百里醌对内皮祖细胞的抑制作用

木海琦 杨 森 王怡君 陈映鹤

血管生成即在原先存在的血管基础上血管内皮细胞生殖、迁移并重塑形成新的成熟血管［1］。血管生成在恶性肿瘤生长和转移中扮演着重要的角色，通过抑制肿瘤血管生长可抑制肿瘤生长和转移，从而改善病人预后［2］。在循环外周血中存在的干细胞－内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)具有自我增殖和定向归巢的特性，还可定向分化为血管内皮细胞，从而在新生血管生成中发挥了重要作用。一种从中东国家的黑种草籽油中分离出来的主要有效单体－百里醌，近年来证实其具有强大的抑瘤效应，同时百里醌可抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)介导的血管生长［3］。但百里醌对EPCs增殖及功能的影响却未曾报道。因此，本研究将探讨百里醌对EPCs生长及功能的影响，并探讨其可能机制。

材料与方法

1．主要药品和试剂:百里醌购自美国Sigma公司;胎牛血清(FBS)和含EDTA胰酶购自美国Gibco公司;EGM－2培养基购自瑞士LONZA公司;人工重组基膜(matrigel)购自美国BD公司;一抗小鼠抗血管内皮生长因子受体－2(VEGFR－2)单克隆抗体、兔抗Ⅷ因子多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;人纤连蛋白(human fibronectin，HFN)购自加拿大Chemicon公司;DiI－ac－LDL购自美国Molecular probe公司;ABC免疫组化检测试剂盒和AEC染色试剂盒购自华美生物工程公司;MMP－2、MMP－9和β－actin抗体购自美国Epitomics公司。百里醌用无水乙醇配制成10mmol/L，－20℃冰箱保存，用时用不含血清的EGM－2培养基稀释成所需浓度。

2．EPCs的分离和培养:收集2010年9～12月弃用的健康新生儿脐带血液5例(温州医学院附属第二医院产科)，每次采集脐血量约30ml。采用密度梯度离心法收集脐血中的单个核细胞接种在包被有HFN 10cm2培养皿中。加入3ml含10%胎牛血清的EGM－2培养液，24h后更换全部培养液。此后7天内每天更换一半培养液，7天后每3天更换全部培养液，同时观察细胞生长情况。等待原代细胞生长汇合后传代进行下一步实验。

3．DiI－ac－LDL吞噬试验:取第2代细胞，吸去原培养基后经PBS洗涤3次后，DiI－ac－LDL以4mg/L的终浓度加入培养液，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育4h，吸去培养基，用PBS再洗涤3次，2%多聚甲醛固定细胞20min后，在荧光显微镜(OLYMPUS，BX51TF)下观察细胞荧光。吞噬DiI－ac－LDL的培养细胞发红色荧光。用不加 DiI－ac－LDL的同批培养细胞作空白对照组。阴性对照组为胰腺癌细胞株PANC－1。

4．VEGFR－2、Ⅷ因子及CD34免疫组化:取第2代细胞接种至24孔板中，培养至贴壁。经多聚甲醛固定20min，0.3%H2O2－甲醇液封闭内源性过氧化物酶10min，PBS浸洗后分别加1∶100稀释的VEGFR－2、Ⅷ因子及CD34抗体于4℃下孵育过夜。二抗结合参照ABC免疫组化检测试剂盒说明书进行，之后用AEC染色试剂染色，苏木素复染，在倒置相差显微镜下(Nikon，TS100)观察染色结果。阴性对照组为胰腺癌细胞株PANC－1。

5．CCK－8法检测细胞增殖:收集处于对数生长期的EPCs细胞，制成单细胞悬液，以每孔5×103个细胞接种到96孔板，过夜待细胞贴壁后，分别加入不同浓度百里醌(10、20、40和80nmol/L)作用12h，同时设置空白调零组(不加细胞加入等量的PBS)，以及阴性对照组(加入等量的溶媒)。药物作用结束前1h，各孔加入0．01ml CCK－8溶液，继续培养1h，酶标仪测A450值，实验重复3次。细胞存活率=(实验组A450值－空白调零组A450值)/(对照组A450值－空白调零组A450值)×100%

6．侵袭实验:在24孔Transwell小室(Corning公司，美国)滤膜上方涂敷人工基膜(Matrigel)50μl，放置于37℃培养箱孵育5h，使其形成凝胶状。计数2×104个细胞加入100μl不含血清的EGM－2培养基中至入上室，分别加入不同浓度百里醌(10、20、40和80nmol/L)，以溶媒作为对照组。下层培养孔加500μl含20%胎牛血清的EGM－2培养基，每组设5个复孔。培养12 h后取出滤膜，小心用棉球棒擦掉小室内表面未穿过膜的细胞，甲醛固定后结晶紫染色，至倒置显微镜下计数膜背面的细胞数，随机计数5个视野，计算平均值。每组重复3次。

7．小管形成实验:4℃下于96孔板中每孔加入100μl Matrigel，铺平后置37℃培养箱内固定5h。以每孔4×104细胞接种于培养板，加入不同浓度百里醌(10、20、40和80nmol/L)，以溶媒为对照组，每组设5个复孔。37℃培养箱培养12h后，倒置显微镜下观察并拍照，计数不同浓度百里醌作用后EPCs小管生成数。

8．Western blotting检测 EPCs中 MMP－2和 MMP－9的表达:收集处于对数生长期的EPCs细胞，不同浓度百里醌(10nmol/L、20nmol/L)作用EPCs细胞12h后，RIPA裂解液裂解细胞，提取上清液，测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品(20微克/孔)，8%SDS－PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭后滴加兔抗人MMP－2/9抗体为第一抗体，HRP标记的羊抗兔IgG为第二抗体，ECL显色，X线胶片曝光。

结 果

1．DiI－ac－LDL摄取特性:荧光显微镜下观察到约 (85．6±4．9)%的细胞Dil－ ac － LDL吞噬试验为阳性，此细胞为正在分化的EPCs［4］。胰腺癌细胞吞噬试验阴性，见图1。

图1 内皮祖细胞Dil－ac－LDL吞噬试验(×400)

2．VEGFR－2、Ⅷ因子和 CD34免疫组化结果:用免疫细胞染色法对细胞染色后发现细胞表面相关抗原VEGFR－2、Ⅷ因子和 CD34表达均为阳性，此类细胞被认为是正在分化的 EPCs(图2)。胰腺癌PANC－1细胞各抗原表达均为阴性。

3．百里醌对体外EPCs增殖的影响:百里醌可显著抑制EPCs增殖，呈浓度依赖性。EPCs经不同浓度百里醌(10、20、40和80nmol/L)作用12h后，细胞存活率分别为 93．4%、76．3%、64.5% 和 42．3%(图3);百里醌浓度高于10nmol/L开始显著抑制EPCs增殖，有统计学差异(p＜0．05);百里醌作用EPCs细胞12h 后 IC50为51．2nmol/L。

图2 EPCs经VEGFR－2、Ⅷ因子和 CD34细胞免疫组化染色后倒置显微镜下观察(×200)A．VEGFR －2;B．Ⅷ;C．CD34

图3 CCK－8法检测不同浓度百里醌对EPCs增殖的影响

4．百里醌对体外EPCs侵袭的抑制作用:百里醌对体外EPCs侵袭有抑制作用，呈浓度依赖性(图4)。百里醌(10、20、40和80nmol/L)处理 EPCs 12 h后每高倍镜(×200)下侵袭细胞数分别为31．1±3．8、18．1 ± 2．6 和 15．3 ± 2．3，与对照组(34．3 ±5.3)相比较，10nmol/L百里醌不能显著抑制EPCs的侵袭行为(P＞0．05);而百里醌(20～80nmol/L)可显著抑制EPCs体外侵袭，有统计学意义(p＜0.05)。

5．百里醌对EPCs体外血管生成的抑制作用:百里醌作用EPCs后，不仅小管数目减少，而且管腔不完整。不同浓度百里醌(10、20、40和80nmol/L)作用 EPCs 12h后，倒置显微镜下观察，每高倍镜(200×)下小管生成数为 37．8 ±5．8、23．4 ±4．9、19.1 ±3．4 和17．3 ±3．8，与对照组(51．6 ±7．8)相比较，均有统计学意义(p＜0．05)。

6．百里醌对 EPCs中MMP－2和MMP－9表达的影响:Western blotting结果表明，低浓度(10nmol/L)百里醌对EPCs中MMP－2蛋白表达无明显影响，但高浓度(20nmol/L)的百里醌开始显著下调MMP－2在EPCs中的表达;百里醌(10～20nmol/L)可明显抑制EPCs中MMP－9的表达，以20nmol/L百里醌抑制作用最明显(图6)。

图6 不同浓度的百里醌作用EPCs 12h后，对MMP－2和MMP－9蛋白表达的影响，以β－actin为内参

讨 论

新生血管形成是由一系列步骤组成的生物学过程，包括内皮细胞增殖和迁移、血管管腔的形成与存活［4，5］。在健康成人中，内皮细胞一般处于休眠状态，新生血管形成在伤口愈合、炎症反应和月经等生理过程中被严格限制着。而在肿瘤侵袭和转移中，新生血管形成扮演着极为重要的角色，一旦肿瘤拥有诱导血管生长的能力，肿瘤生长就变得极富有侵犯性，从而为肿瘤侵袭和转移提供便利和可能。因此，抑制内皮细胞增殖和功能体现，可有效抑制肿瘤中血管新生。有研究表明百里醌可有效抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖及其功能，从而在其抑制前列腺癌生长中发挥了一定的作用，且没有细胞毒性，表明百里醌具有一定的抗血管生成的作用［3，6］。

EPCs是一群能增殖分化为成熟血管内皮细胞，并参与内皮损伤修复和出生后血管新生的前体细胞。内皮损伤后的修复过程除了相邻成熟内皮细胞延展修复外，还有一部分是通过外周血中的EPCs分化为成熟内皮细胞完成的［7］;同时在肿瘤血管新生过程中，EPCs从骨髓等组织中被动员至外周血液中，进而增殖和分化为成熟内皮细胞，从而在肿瘤生长的早期起到至关重要的作用，表明EPCs在血管形成的发生和发展中扮演了重要角色［8］。在本研究中，笔者成功培养出人脐血内皮祖细胞，并经DiI－ac－LDL吞噬试验证实细胞的内皮属性，而VEGFR－2、VIII因子和CD34细胞免疫组化也进一步证实了细胞的内皮属性。同时体外实验表明百里醌可显著抑制EPCs增殖，初步表明百里醌有抑制EPCs参与的血管生成的作用，与文献报道相近［3］。

恶性肿瘤可动员包括EPCs在内的内皮细胞至血管新生部位，这是一个多因素、多步骤的生物学过程。在动员过程中，EPCs穿过细胞外基质至血管新生灶是动员过程的重要环节。EPCs侵袭的发生有赖于EPCs迁移能力的增强、不同时相细胞的黏附和解黏附、多种蛋白水解酶的表达及活性的增加从而降解细胞外基(ECM)［9］。而金属蛋白酶家族(MMPs)在促进细胞迁移和细胞外基质降解等生物学行为过程中发挥了关键作用，其中MMP－2在降解细胞外基质蛋白中扮演着重要角色，从而在细胞侵袭和转移中发挥重要作用［10］。另外，在新生血管形成过程中，MMP－2在调控内皮细胞管腔样结构形成过程中也发挥了一定作用［11］。因此，抑制MMP－2可显著抑制内皮细胞侵袭和血管形成［12］。在本研究中，高浓度百里醌可显著抑制EPCs中MMP－2的表达，同时百里醌还能显著抑制EPCs体外侵袭和小管形成，表明MMP－2在百里醌抑制EPCs功能体现中发挥了一定作用。而MMPs家族另一重要成员MMP－9可特异性降解被称为细胞外基质脊椎的Ⅳ型胶原，从而在促进细胞侵袭和迁移中起到举足轻重的作用;而抑制MMP－9可显著抑制肿瘤侵袭和转移［13］;与此同时，MMP－9在人肝细胞癌中的表达水平还和肿瘤血管密度呈正相关，MMP－9的抑制剂还可显著抑制内皮细胞增殖和迁移，而抑制MMP－9可显著抑制肿瘤诱导血管生长［14～16］。本研究中，笔者也观察到低浓度百里醌即可明显下调EPCs中MMP－9的表达水平，与本研究中观察到的低浓度百里醌可显著抑制EPCs侵袭和小管形成的实验结果相符，从而表明百里醌可通过下调EPCs中MMP－9的水平从而抑制EPCs的功能体现，而百里醌有望作为新型的MMPs，特别是MMP－9的抑制剂应用于临床抗肿瘤治疗。当今，已有一系列MMPs的抑制剂作为抗癌和抗肿瘤的治疗措施应用到临床试验，并且收到满意的疗效［17］。因此，开发新颖低毒而更有效的MMPs抑制剂联合传统化疗药物有可能成为治疗恶性肿瘤的新趋势。

综上所述，本次实验结果表明百里醌可显著抑制体外EPCs增殖、侵袭及小管形成，同时百里醌还能抑制MMP－2和MMP－9在EPCs中的表达，因此，笔者推断百里醌可能通过其下调MMP－2和MMP－9的表达从而对EPCs增殖和功能产生抑制作用。从而为百里醌作为一种新型血管生成抑制剂应用于临床提供了一定的实验参考。

1 Bussolino F，Mantovani A，Persico G．Molecular mechanisms of blood vessel formation［J］．Trends Biochem Sci，1997，22(7):251 －256

2 Folkman J．Tumor angiogenesis:therapeutic implications［J］．N Engl J Med，1971，285(21):1182－1186

3 Yi T，Cho SG，Yi Z，et al．Thymoquinone inhibits tumor angiogenesis and tumor growth through suppressing AKT and extracellular signal－ regulated kinase signaling pathways［J］．Mol Cancer Ther，2008，7(7):1789－1796

4 Vasa M，Fichtlscherer S，Aicher A，et al．Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease［J］．Circ Res，2001，89(1):E1－E7

5 Bussolino F，Mantovani A，Persico G．Molecular mechanisms of blood vessel formation［J］．Trends Biochem Sci，1997，22(7):251 －256

6 Banerjee S，Kaseb AO，Wang Z，et al．Antitumor activity of gemcitabine and oxaliplatin is augmented by thymoquinone in pancreatic cancer［J］．Cancer Res，2009，69(13):5575 －5583

7 Suzuki T，Nishida M，Futami S，et al．Neoendothelialization after peripheral blood stem cell transplantation in humans．A case report of a Tokaimura nuclear accident victim ［J］．Cardiovasc Res，2003，58(2):487－492

8 Nolan DJ，Ciarrocchi A，Mellick A S，et al．Bone marrow － derived endothelial progenitor cells are a major determinant of nascent tumor neovascularization［J］．Genes Dev，2007，21(12):1546－1558

9 Bohle A S，Kalthoff H．Molecular mechanisms of tumor metastasis and angiogenesis［J］．Langenbecks Arch Surg，1999，384(2):133 －140

10 Sugiura Y，Shimada H，Seeger RC，et al．Matrix metalloproteinases－2 and－9 are expressed in human neuroblastoma:contribution of stromal cells to their production and correlation with metastasis［J］．Cancer Res，1988，58(10):2209－2216

11 Ahmed MM，Mohammed SH．Matrix metalloproteinases 2 and 9 in situ mRNA expression in colorectal tumors from Iraqi patients［J］．Indian JPathol Microbiol，2011，54(1):7 －14

12 Guo J，Xiao B，Liu Q，et al．Suppression of C －myc expression associates with anti－proliferation of aloe－emodin on gastric cancer cells［J］．Cancer Invest，2008，26(4):369 －374

13 Ho LL，Chen WJ，Lin－Shiau SY，et al．Penta－O －galloyl－beta－Dglucose inhibits the invasion of mouse melanoma by suppressing metalloproteinase－9 through down－regulation of activator protein－1［J］．Eur JPharmacol，2002，453(2－3):149－158

14 Sun MH，Han XC，Jia MK，et al．Expressions of inducible nitric oxide synthase and matrix metalloproteinase－9 and their effects on angiogenesis and progression of hepatocellular carcinoma［J］．World J Gastroenterol，2005，11(38):5931 －5937

15 Yao JS，Zhai W，Young WL，et al．Interleukin －6 triggers human cerebral endothelial cells proliferation and migration:the role for KDR and MMP－9［J］．Biochem Biophys Res Commun，2006，342(4):1396－1404

16 Rao JS，Gondi C，Chetty C，et al．Inhibition of invasion，angiogenesis，tumor growth，and metastasis by adenovirus－ mediated transfer of antisense uPAR and MMP－9 in non－small cell lung cancer cells［J］．Mol Cancer Ther，2005，4(9):1399 －1408

17 Watanabe K，Yoshida D，Noha M，et al．Suppression of matrix metalloproteinase－2 and －9 mediated invasiveness by a novel matrix metalloproteinase inhibitor，BE16627B［J］．JNeurooncol，2001，52(1):1－9