抑制ClC－3表达对顺铂诱导人卵巢癌SKOV3／DDP细胞凋亡的促进作用

于春艳，韩命龙，钟加滕，孙连坤，刘玉和

（1.北华大学基础医学院病理学教研室，吉林 吉林132013；2.吉林市公安局昌邑分局法医室，吉林 吉林132001；3.吉林大学白求恩医学院病理生理学教研室，吉林 长春130021）

抑制ClC－3表达对顺铂诱导人卵巢癌SKOV3／DDP细胞凋亡的促进作用

于春艳1，韩命龙2，钟加滕3，孙连坤3，刘玉和1

（1.北华大学基础医学院病理学教研室，吉林 吉林132013；2.吉林市公安局昌邑分局法医室，吉林 吉林132001；3.吉林大学白求恩医学院病理生理学教研室，吉林 长春130021）

目的：探讨抑制氯离子通道－3（ClC－3）基因表达对顺铂（DDP）诱导的人卵巢癌SKOV3／DDP细胞凋亡的促进作用，为卵巢癌的治疗提供实验依据。方法：转染pSH1－siRNA－ClC－3重组质粒至人卵巢癌SKOV3／DDP细胞，Western blotting方法检测转染重组质粒对ClC－3蛋白表达的影响；MTT法检测细胞增殖率；Western blotting方法检测凋亡相关蛋白细胞色素C（Cyt－c）及Caspase－3活化片段蛋白表达。结果：与SKOV3细胞比较，SKOV3／DDP细胞中ClC－3蛋白表达水平增加（P＜0.05）；转染pSH1－siRNA－ClC－3重组质粒后，SKOV3／DDP细胞ClC蛋白表达水平明显降低；ClC－3－siRNA联合DDP作用后，SKOV3／DDP细胞增殖率下降（P＜0.05），Cyt－c和Caspase－3活化片段蛋白表达水平增加（P＜0.05）。结论：pSH1－siRNA－ClC－3可有效抑制SKOV3／DDP细胞ClC－3蛋白的表达，并促进DDP诱导SKOV3／DDP细胞凋亡。

卵巢肿瘤；氯通道－3；顺铂；细胞凋亡

顺铂（cisplatin，DDP）是临床上常用的抗肿瘤药物，诱导肿瘤细胞发生凋亡［1］。然而，采用DDP治疗时常常发生肿瘤细胞获得耐药性［2－3］而使肿瘤治疗无效。目前，肿瘤细胞对抗肿瘤药物发生药物耐药的机制仍是研究的热点，有几种机制被认为与肿瘤细胞发生耐药有关，例如药物在肿瘤细胞内聚集减少、DNA修复损伤能力增强和肿瘤细胞发生凋亡能力降低等，但肿瘤细胞产生耐药的具体机制还尚不明确。研究［4］发现：细胞凋亡常常伴随发生凋亡细胞容积减少；而凋亡细胞容积减少常被某些离子通道例如钾离子和氯离子通道（chloride channel，ClC）传导增强、导致离子外流所诱导。当凋亡诱导因子刺激后，ClC的正常活性通过引起凋亡细胞容积减少而诱导细胞发生了凋亡［5］。本实验以人卵巢癌SKOV3、SKOV3／DDP细胞为研究对象，观察DDP对SKOV3／DDP细胞存活率、凋亡蛋白表达水平的影响，探讨ClC－3在卵巢癌细胞发生耐药中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 人卵巢癌细胞株SKOV3和SKOV3／DDP购自中国科学院和北京协和医院。新生小牛血清 购自Gibco公司，Iscove’s Modified Dulbecco’s Media（IMDM）培养基购自Hyclone公司；siRNA表达载体（pSilencer TMneo3.1－H1） 购 自 美 国 Ambion 公 司； 脂 质 体（lipofectamine2000）试剂购自Invitrogen公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、质粒提取试剂盒和寡核苷酸合成均购自Takara公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）粉末购自Sigma公司；细胞裂解液RIPA购 自 碧 云 天 公 司；ClC－3、Cyt－c、Caspase－3、Cleaved Caspase－3 和 β－actin 抗 体 均 购 自 Santa Cruz公司；注射用DDP（冻干型）购自齐鲁制药有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养 SKOV3和SKOV3／DDP细胞均采用含10% 胎牛血清的IMDM培养液养，于37℃、5%CO2培养箱内培养。2种细胞均采用0.4%胰酶消化传代培养。DDP耐受型细胞株SKOV3／DDP在培养过程中需要加入1 mg·L－1DDP，以维持SKOV3／DDP细胞表型及耐药性。

1.3 实验分组 质粒转染入SKOV3／DDP细胞内，实验共分4组：转染pSilencer 3.1－H1质粒（scramble） 组； 转 染 pSilencer 3.1－H1 质 粒 ＋DDP（scramble＋cisplatin）组，DDP终含量为6 mg·L－1，给药 24 h；转染 pSilencer 3.1－H1－siRNA－ClC－3重组质粒（ClC－3－siRNA）组；转染pSilencer 3.1－H1－siRNA－ClC－3 ＋ DDP（ClC－3－siRNA＋ cisplatin）组，DDP终含量为6 mg·L－1，给药24 h。

1.4 重组质粒pSilencerTMneo3.1－H1构建 根据GenBank中人ClC－3基因 mRNA的已知序列（AF191729） 和 本 实 验 室 前 期 工 作［6］， 在www.amhion.com在线设计siRNA模板序列如下：Sense，3′－AGCTACACAAACTGCTTGACCTATGATTAACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG－5′；Aniisense，3′－CGGCGAAGCTTTTTCCAAAAAATTAATCATAGGTCAAGCAGCTACACAAACTGC－5′。构建的重组质粒经上海生工生物工程技术服务有限公司自动测序仪进行序列测定。

1.5 MTT法检测细胞增殖率 各实验组细胞以104／孔接种至96孔板中，每孔接种量为100μL，每组5复孔，于培养结束前4 h，加入5 g·L－1MTT 20μL。培养结束后，倾去培养基，每孔加入二甲基亚枫（DMSO）150μL，振荡混匀，使结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定其吸光度（A）值。设对照组细胞增殖率为100%，其余各组增殖率＝（各组A值／对照组A值）×100%。

1.6 Western blotting法检测蛋白表达量 待细胞生长到对数生长期时，根据实验设计分为4组，离心收集细胞，每瓶加入120μL RIPA，混匀，取50μg蛋白质样品进行SDS－PAGE电泳，转至硝酸纤维素膜上；5%奶粉室温封闭2 h后，用含0.01%Tween 20的TBS缓冲液（TBST）漂洗3次，每次10 min；加入相应的抗体（1∶200），4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1000），37℃摇床温育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB显色，采用凝胶图像分析系统分析拍照，并以β－actin作为内参照。

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析。细胞生存率和蛋白表达水平以±s表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 SKOV3和SKOV3／DDP细胞中ClC－3蛋白的表达水平 收集细胞，提取细胞总蛋白，Western blotting法 分析2种细胞中的ClC－3蛋白的表达，与SKOV3 细胞（0.33±0.03）比较，SKOV3／DDP 细 胞 中 的 ClC－3蛋 白 表 达 水 平（1.23±0.06）增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 SKOV3和SKOV3／DDP细胞中ClC－3蛋白的表达Fig.1 The expressions of ClC－3 proteins in SKOV3 and SKOV3／DDP cells

2.2 各组SKOV3／DDP细胞中ClC－3蛋白表达水平 与scramble组［（98.0±5.7）%］比较，ClC－3－SiRNA 组SKOV3／DDP细胞内ClC－3蛋白表达水平［（53.7±5.6）%］降低（P＜0.05）。见图2。

图2 ClC－3－siRNA 重组质粒作用后SKOV3／DDP细胞中ClC－3蛋白的表达Fig.2 The expressions of ClC－3 proteins in SKOV3／DDP cells after treated with ClC－3－siRNA plasmid

2.3 抑制ClC－3表达后SKOV3／DDP细胞增殖率

对照组细胞增殖率设为100%，scramble＋cisplatin组细胞增殖率为（95.4±5.2）%；ClC－3－siRNA＋DDP组细胞增殖率为（63.5±6.5）%，明显低于scramble＋cisplatin组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 ClC－3－siRNA作用后SKOV3／DDP细胞凋亡蛋白Cyt－c和Caspase－3活化片段的蛋白表达水平

Western blotting检测，与scramble＋cisplatin组（0.03±0.02）比较，ClC－3－siRNA＋cisplatin组胞浆Cyt－c（0.53±0.16）和 Cleaved Caspase－3（0.36±0.11）蛋白表达水平增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 DDP作用下 SKOV3／DDP细胞 Cyt－c和 Cleaved Caspase－3蛋白的表达Fig.3 The expressions of Cyt－c and Cleaved Caspase－3 proteins in SKOV3／DDP cells after treated with DDP

3 讨 论

DDP是目前临床上术后常规治疗方案中联合应用较广泛的一线化疗药物，已在卵巢癌、头颈部肿瘤和肺癌中卓见成效。与其他抗肿瘤药物一样，DDP的抗肿瘤活性以诱导肿瘤细胞发生凋亡为主［1，7］。Cyt－c及 Caspase－3蛋白被认为是线粒体凋亡诱导因子，上述蛋白激活可以启动细胞凋亡过程［8］。本文作者的前期研究［9］发现：DDP作用的SKOV3细胞中的上述蛋白表达增加，而SKOV3／DDP细胞中上述蛋白没有表达，提示SKOV3／DDP细胞可能对DDP产生耐药。细胞凋亡时细胞容积减少，常常发生在Caspase激活之前［4］。ClC阻断剂NPPB上调K562及RK562细胞的ClC－3表达，使2种细胞对DDP诱导的细胞凋亡不敏感［7］。前期研究［9］结果显示：与SKOV3细胞比较，DDP对SKOV3／DDP细胞存活率的抑制作用减弱。本研究结果显示：抑制ClC－3表达增加了DDP对SKOV3／DDP细胞存活率的抑制作用，增加了凋亡相关蛋白Cyt－c和Cleaved Caspase－3表达，提示ClC－3可能参与了肿瘤细胞对DDP产生耐药性过程。研究［10］发现：氯离子（Cl－）是体内最多的阴离子，其通过跨膜转运和阴离子通道发挥各种生物功能，已经证明ClC在细胞的生理和病理情况下发挥重要作用，如渗透压调节、离子分泌、细胞容积调节和细胞迁移及增殖等。抑制氯离子通道ClC－2基因表达，能抑制DDP作用下神经胶质瘤U251细胞的侵袭力［11］。ClC－3通过增加细胞内晚期内吞体的酸性，增加了DDP的耐药性［7］。DDP作用下，SKOV3细胞中内质网应激蛋白表达明显增加，而SKOV3／DDP细胞中内质网应激蛋白没有受影响，推测SKOV3／DDP细胞对DDP耐药与内质网应激相关因子表达差异有关［9］。抑制ClC－3表达通过抑制自噬而增加了DDP对U251细胞的敏感并增加了 U251细胞凋亡［6］。因此，ClC－3引起SKOV3／DDP细胞对DDP产生耐药的机制还需进一步深入研究。

［1］Xu Y，Yu HM，Qin HJ，et al.Inhibition of autophagy enhances cisplatin cytotoxicity through endoplasmic reticulum stress in human cervical cancer cells［J］.Cancer Lett，2012，314（2）：232－243.

［2］Chang XB.Molecular mechanism of ATP－dependent solute transport by multidrug resistance－associated protein 1［J］.Methods Mol Biol，2010，596：223－249.

［3］Yu H，Su J，Xu Y，et al.p62／SQSTM1 involved in cisplatin resistance in human ovarian cancer cells by clearing ubiquitinated proteins［J］.Eur J Cancer，2011，47（10）：1585－1594.

［4］Shimizu T，Numata T，Okada Y.A role of reactive oxygen species in apoptotic activation of volume－sensitive Cl－channel［J］.Proc Natl Acad Sc USA，2004，101（7）：6770－6773.

［5］Okada Y，Maeno E，Shimizu T，et al.Dual roles of plamalemmal chloride channels in induction of cell death［J］.Eur J Physio，2004，448（3）：287－295.

［6］苏 静.抑制细胞内氯通道对胶质瘤肿瘤生物学特性影响的研究［D］.长春：吉林大学，2010.

［7］Xu Y，Zheng H， Kang JS， et al. 5－Nitro－2－（3－Phenylpropylamino）benzoic acid induced drug resistance to cisplatin in human erythroleukemia cell lines［J］.Anat Rec，2011，294（6）：945－952.

［8］Zhong JT，Xu Y，Yi HW，et al.The BH3 mimetic S1 induces autophagy through ER stress and disruption of Bcl－2／Beclin 1 interaction in human glioma U251 cells［J］.Cancer Lett，2012，323（2）：180－187.

［9］周 彤，于慧美，苏 静，等.顺铂诱导人卵巢癌SKOV3和SKOV3／DDP细胞内质网应激差异的研究［J］.中国实验诊断学，2011，15（5）：809－811.

［10］Jentsch TJ，Friedrich T，Schriever A，et al.The ClC chloride channel family［J］.Pflugers Arch，1999，437（6）：783－795.

［11］苏 静，周 磊，张宏宇，等.氯通道ClC－2反义寡核苷酸对顺铂作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响［J］.吉林大学学报：医学版，2009，35（1）：43－46.

Promoting effect of inhibiting ClC－3 expression on apoptosis induced by cisplatin in human ovarian cancer SKOV3／DDP cells

YU Chun－yan1，HAN Ming－long2，ZHONG Jia－teng3，SUN Lian－kun3，LIU Yu－he1
（1.Department of Pathology，College of Basic Medicine，Beihua University，Jinlin 132013，China；2.Department of Firensic Medicine，Jilin Public Security Bureau Changyi Branch，Jinlin 132001，China；3.Department of Pathophysiology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To observe the promoting effect of inhibiting chloride channel－3（ClC－3）gene expression on the apoptosis of human ovarian cancer SKOV3／DDP cells induced by cisplatin（DDP），and to provide the experimental basis for treatment of ovarian cancer.Methods The recombinant plamid pSH1－siRNA－ClC－3 was transfected into SKOV3／DDP cells.The ClC－3 expression changes in SKOV3／DDP cells transfected with pSH1－SiRNA－ClC－3 was detected by Western blotting.The vitality of SKOV3／DDP cells was measured by MTT assay.The expression levels of apoptosis－related proteins cytochrome C（Cyt－C）and Cleaved Caspase－3 were determined by Western blotting.Results Compared with SKOV3 cells，the ClC－3 expression levels in SKOV3／DDP cells was increased（P ＜0.05）.Transfection of pSH1－SiRNA－ClC－3 suppressed the expression of ClC－3 efficiently in SKOV3／DDP cells（P＜0.05）.The proliferation rate of SKOV3／DDP cells was decreased（P＜0.05），and the cyt－C and Cleaved Caspase－3 expression were increased after treated with ClC－3－siRNA combined with DDP（P＜0.05）.Conclusion pSH1－SiRNA－ClC－3 could suppress the expression of ClC－3 efficiently and enhance the apoptosis induced by DDP in SKOV3／DDP cells.

ovarian tumor；chloride channel－3；cisplatin；apoptosis

R737.31

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1106－04

2012－06－19

吉林省教育厅资助课题（吉教科合字2009第156号，吉教科合字2011第117号，吉教科合字2012第394号）；吉林省科技厅自然科学基金资助课题（201215103）

于春艳（1975－），女，吉林省吉林市人，副教授，医学博士，主要从事肿瘤病理学方面的研究。

刘玉和（Tel：0432－64608556，E－mail：bhlyh1959＠163.com）