双表达重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2－9复合纳米羟基磷灰石／聚酰胺66融合器用于山羊椎间融合的效果评价

马金梁，黄 帆，汪 洋，罗进勇，邓忠良

（1.重庆医科大学附属第二医院骨科，重庆400010；2.重庆医科大学分子医学实验室，重庆400016）

双表达重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2－9复合纳米羟基磷灰石／聚酰胺66融合器用于山羊椎间融合的效果评价

马金梁1，黄 帆1，汪 洋1，罗进勇2，邓忠良1

（1.重庆医科大学附属第二医院骨科，重庆400010；2.重庆医科大学分子医学实验室，重庆400016）

目的：比较双表达重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2－9（Adv－BMP2－9）与单表达Adv－BMP9和Adv－BMP2复合纳米羟基磷灰石／聚酰胺66（n HA／PA66）融合器用于山羊椎间融合的效果，验证BMP2与BMP9的协同成骨作用。方法：选用40只中国青山羊行L2－3、L3－4和L4－5腰椎间融合术，共融合120个腰椎间隙。每个腰椎间隙植入n HA／PA66融合器复合以下4种腺病毒之一，Adv－BMP9（Adv－BMP9组，n＝30）、Adv－BMP2（Adv－BMP2组，n＝30）、Adv－BMP2－9（Adv－BMP2－9组，n＝30）和 Adv－GFP（Adv－GFP组，n＝30）。术后24周处死所有山羊，取出融合节段标本，行影像学评估和生物力学分析。结果：X线检测，术前、术后各组间椎间隙高度（DSH）比较差异无统计学意义（P＞0.05）；各组标本椎间融合率，Adv－BMP2－9组为70%（21／30），Adv－BMP9组为53%（16／30），Adv－BMP2组为43%（13／30），而 Adv－GFP组为30%（9／30）。各组椎间CT融合度评分，Adv－hBMP2－9组、Adv－hBMP9组、Adv－hBMP2组和 Adv－GFP组依次为52.29±0.72、44.02±0.67、38.83±0.86和28.65±0.47，各组间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。生物力学评估，Adv－BMP2－9组融合节段刚度大于Adv－BMP9组（P＜0.05）；Adv－BMP9组融合节段刚度大于Adv－BMP2组，但差异无统计意义（P＞0.05）。实验期间各组山羊均未观察到局部或远处感染、发热和异物排斥反应。结论：双表达Adv－BMP2－9复合n HA／PA66融合器对山羊椎间融合效果优于单表达 Adv－BMP9或Adv－BMP2，BMP2与BMP9具有协同成骨作用。

骨形态发生蛋白；重组腺病毒；椎间融合；纳米羟基磷灰石；聚酰胺

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）属于转化生长因子（transforming growth factor，TGF）超家族的成员之一。BMP不仅有促进成骨功能，而且具有促进软骨细胞的成骨、血管发生和脂肪细胞分化等多种生物学功能［1－3］。目前发现的具有诱导成骨分化的BMP主要有BMP2、4、6、7和9，其中重组人骨形态生成蛋白（rhBMP）2、7已经在临床用于骨折延迟愈合、骨折骨不连、骨缺损和脊柱融合术的治疗，并 取 得 了 一 定 的 治 疗 效 果［4－5］。 然 而 rh BMP2、rhBMP 7的价格昂贵，在修复成骨的同时也存在成脂现象［6］，成骨能力不理想导致的手术失败率也较高，因此寻找具有更强成骨能力的因子或者因子的组合十分迫切。对重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白（Adv－BMP）2、4、6、7和9的研究［7］显示：人肌肉成纤维细胞瘤细胞C2C12、小鼠间充质干细胞系C3H10细胞和裸鼠皮下注射的体外和体内实验中，BMP9诱导成骨能力远强于BMP2和BMP7。 关 于 Adv－BMP2、 Adv－BMP4、Adv－BMP6、Adv－BMP7 和 Adv－BMP9 的 研 究 显示：BMP9和BMP2的协同成骨作用最强，但是该结果的准确性受到BMP2和BMP9腺病毒用量以及滴度测定准确性的影响。为了使BMP2和BMP9达到1∶1表达，避免基因表达的相互干扰，准确地研究BMP2和BMP9之间的协同作用及其促进成骨作用，本研究采用双表达BMP2－9的重组腺病毒载体［8］，复合纳米羟基磷灰石聚酰胺66融合器应用于山羊椎间，对其融合效果进行评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 选择40只雌性中国本地青山羊，1～2岁，体质量（30.00±2.08）kg，由重庆医科大学动物实验中心提供。动物合格证号：SYXK（渝）2002007。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求［9］。根据所选40只山羊腰椎L2～L5节段的平均椎间高度（disc space height，DSH），设计实验用纳米羟基磷灰石／聚酰胺66椎间（n－HA／PA66） 融 合 器。 腺 病 毒 BMP2－9、BMP9和BMP2由美国芝加哥大学分子肿瘤研究室提供，重庆医科大学分子医学实验室保存。

1.2 动物分组及给药 40只成年雌性山羊，行L2－3、L3－4和 L4－5腰椎融合术。每只山羊3个腰椎间隙分别被植入n HA－PA66融合器复合以下4种腺病 毒 的 3 种： Adv－BMP2－9、 Adv－BMP2、Adv－BMP9和 Adv－GFP。按植入物不同分为 Adv－BMP2－9组（n＝30）、Adv－BMP9 组（n＝30）、Adv－BMP2（n＝30）和Adv－GFP组（n＝30）。所有动物麻醉成功后取右侧卧位，拍腰椎侧位X线片。取左侧肾型切口，切口起自羊左肋缘下3.0 cm、 距 后 中 线 约 10.0 cm， 止 于 髂 棘 上3.0 cm，切口长约11.0 cm。定位确定L2－3、L3－4和L4－5椎间盘。取同侧自体髂骨大小约10 mm×10 mm×8 mm，均分成3份剪碎，分别加入等量等 滴 度（1×109IU·m L－1，0.5 m L）的 Adv－BMP2－9、Adv－BMP9、Adv－BMP2和 Adv－GFP中的3种，充分混匀后分别填至3个n HA－PA66融合器内，压实备用。分别切除 L2－3、L3－4、和L4－5椎间盘，刮除终板软骨至出血，保留前纵韧带。随机取n HA－PA66融合器分别植入3个椎间隙。于术后第2天开始，每天分2次臀部肌肉注射青霉素钠320万单位，共3 d。第2、4和6天消毒手术切口。观察各组山羊腰部外观，肢体活动、进食和伤口愈合情况。

1.3 影像学分析山羊椎间融合率和融合度评分术后即刻和每4周摄羊腰椎X线正侧位片，在X线片上测量各手术节段的DSH（图1），计算各组DSH平均值。X线融合率分析标准：0级，无新骨形成；1级，植入物和椎骨间可见到少量骨小梁；2级，植入物和椎骨间可见明显的骨长入，但融合不明显；3级，植入物和椎骨完全融合。所有山羊在第24周处死后取出融合节段标本，行螺旋CT扫描，在植入椎间融合器节段处取5个矢状切面，每1 mm 1个层面，每个层面又分为与椎体相接的1、2和3三个区域（图2）进行融合度评分。评分标准：0分，无新生骨的形成；1分，可见新生骨的形成，但椎体与植入物间无骨性连接；2分，椎体与植入物间已形成骨性连接。

图1 腰椎DSH值测量示意图Fig.1 Schematic diagram of measurement of DSH of lumbar vertebra

1.4 山羊椎体力学性能测试 术后24周处死所有山羊，取其中5只山羊腰椎标本，24 h内进行无破坏生物力学测试：取完整的山羊L2～L5椎体标本，剔除腰部肌肉，保留完整骨骼及韧带，用骨水泥将标本两端与上下实验盘固定，用Instron力学测试机进行前屈、后伸、侧屈和旋转4个模式加载［10］。下位椎体固定，一个2 N·m最大力矩加于上位椎体，生物力学强度由载荷－位移曲线初始部分决定并计算。生物力学强度检测指标选用刚度值，单位为牛·米／度（N·m／°）。比较4组山羊腰椎标本融合后的刚度。1.5 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件对数据进行分析。各组标本CT层面融合度评分、不同运动状态下平均刚度以±s表示，组间比较采用t检验。

图2 融合度CT评分分区示意图Fig.2 Partition schematic diagram of CT fusion score

2 结 果

2.1 山羊一般情况 实验过程中有1只山羊术后第2天死亡，以另一只代替。所有动物均无脊髓损伤，术后可以正常饮食，伤口正常愈合。

2.2 各组山羊椎体融合影像学评价 各组融合节段X线片DSH测量，术前和术后各组山羊平均DSH比较差异无统计学意义。X线融合率分析，术后24周时，Adv－BMP2－9组山羊所有椎间隙21个椎间发生了融合（3级），余9个椎间可见明显的骨长入（2级），融合度为70%（21／30）；Adv－BMP9组山羊术后24周16个椎间融合（3级），融合度为53%（16／30）；Adv－BMP2组山羊13个椎间融合（3级），融合度为43%（13／30）；Adv－GFP组山羊。仅9个椎间发生融合，18个椎间可见明显的骨长入，但融合不明显（2级），2个椎间发生了假关节形成（1级），1只发现融合器已脱出，但未脱落，融合度30%（9／30）。所有融合器均未见椎间融合器下沉和碎裂。Adv－BMP2－9组山羊椎体融合率明显高于 Adv－BMP9组和 Adv－BMP2组（P＜0.05）。融合度CT分析，术后24周 时，Adv－BMP2－9组山羊椎间已完全融合（图3A）；Adv－BMP9组山羊所有CT层面均可见植骨块与椎体之间已形成骨性连接（图3B）；Adv－BMP2组山羊椎体所有CT层面均可见新生骨形成，2、3区域的植骨块与椎体之间有骨性连接（图3C）；Adv－GFP组山羊椎体仅3区域的植骨块与椎体之间有骨性连接（图3D）。

各组山羊椎体术后24周时融合度评分：Adv－BMP2－9、Adv－BMP9、 Adv－BMP2 和 Adv－GFP组依次为52.29±0.72、44.02±0.67、38.83±0.86和28.65±0.47，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

图3 各组山羊标本椎间融合度CT评分Fig.3 CT fusion score specimens of goats in various groups

2.3 4组标本不同运动状态下平均刚度Adv－BMP2－9、Adv－BMP9、 Adv－BMP2 和 Adv－GFP组标本融合节段刚度呈递减趋势；Adv－BMP9、Adv－BMP2组间刚度比较差异无统计学意义（P＞0.05）；Adv－BMP2－9组标本的融合节段刚度大于Adv－BMP9组和Adv－BMP2组，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；Adv－BMP2组标本刚度大于Adv－GFP组，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 术后24周各组标本不同运动状态下平均刚度Tab.1 Average stiffness of specimens at different motion state 24 weeks after operation in various groups（n＝30±s，N·m／°）

表1 术后24周各组标本不同运动状态下平均刚度Tab.1 Average stiffness of specimens at different motion state 24 weeks after operation in various groups（n＝30±s，N·m／°）

＊P＜0.05 vs Adv－BMP2－9 group；△P＜0.05 vs Adv－BMP9 group.

Group Average stiffness Fexion Extension Torsion Bending Adv－BMP2－9 5.6±0.35 5.2±0.34 6.6±0.42 6.5±0.39 Adv－BMP9 5.1±0.29＊ 4.7±0.32＊ 6.1±0.31＊ 5.9±0.44＊Adv－BMP2 5.0±0.27＊ 4.5±0.29＊ 6.0±0.51＊ 5.7±0.45＊Adv－GFP 4.5±0.36＊△ 4.1±0.41＊△ 5.3±0.39＊△ 5.0±0.22＊△

3 讨 论

BMP是目前研究的热点，其被认为是成骨能力最强、最具有临床运用前景的成骨因子，但是现在临床使用的骨形成诱导因子BMP2、7价格昂贵，治疗效果不稳定。近来研究［11］显示：BMP9具有异位成骨能力。本课题组前期研究［12］结果显示：BMP9成骨能力较BMP2和BMP7强；BMP9和其他的BMP具有协同成骨的能力，特别与BMP2的协同成骨能力最强［7］。

山羊动物模型是脊柱融合较常用的模型，因为山羊脊柱的生物力学承重轴是脊柱的纵轴，其生物力学特点与人很相似。研究［13－14］表明：山羊颈椎的解剖、力学特点和骨密度植入与人体非常相似。Kandziora等［15］研究显示：山羊 的 C2－3、C3－4节 段的生物力学特性与人体颈椎最为相似，适合进行生物力学测试。本研究采用山羊腰椎融合模型进行实验，并以L2～L5节段作为融合节段。

本研究结果显示：术前和术后4组山羊椎体融合节段DSH差异无统计学意义。术后24周时，Adv－BMP2－9组山羊椎体融合节段的融合率分别较Adv－BMP9组、Adv－BMP2组高。生物力学测定被认为是衡量椎间融合效果的另一个重要客观指标。上述测试结果表明：术后24周Adv－BMP2－9组山羊椎体平均刚度大于Adv－BMP9组，差异有统计学意义；而Adv－BMP9组山羊椎体平均刚度高于Adv－BMP2组，但差异无统计学意义。4组标本中，Adv－GFP组标本融合节段平均刚度最低，与Adv－BMP2组比较差异有统计学意义。影像学及生物力学检测结果显示：术后24周，Adv－BMP2－9组与其余3组标本在组织融合度和力学稳定性方面的比较差异均有统计学意义，说明Adv－BMP2－9组标本达到了良好的融合效果。

本实验中Adv－BMP9组山羊椎间融合率高于Adv－BMP2组，说明Adv－BMP9对椎骨缺损修复效果优于 Adv－BMP2，同卢小娟等［12］的研究结论一致，因此Adv－BMP9是更强的成骨诱导因子。而本实验中Adv－BMP2－9组山羊椎体椎间融合率高 于 Adv－BMP9 和 Adv－BMP2 组， 说 明Adv－BMP2与Adv－BMP9具有协同作用，具体机理尚不明确。Adv－BMP2－9有望为骨肿瘤、骨折愈合和脊柱融合等多种骨骼疾病的基因治疗提供一个作用强且安全和有效的平台。

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Evaluation on effects of bone morphoge netic protein2－9 mediated by co－expressing recombinant adenovirus combined with nano－hydroxyapatite／polyamide 66 cage on lumbar interbody fusion of goats

MA Jin－liang1，HUANG Fan1，WANG Yang1，LUO Jin－yong2，DENG Zhong－liang1
（1.Departments of Orthopedics，Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China；2.Molecular Medicine Laboratory，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To compare the interbody fusion effects of bone morphogenetic protein 2－9（Adv－BMP 2－9）with single expression of Adv－BMP9 or adv－BMP2 mediated by co－expressing recombinant adenovirus combined with nano－hydroxyapatite／polyamide 66（n HA／PA66）cage on lumbar interbody fusion of goats，and to clarify the collaborative osteogenesis effects of BMP2 and BMP9.Methods Interbody fusion was performed at L2－3，L3－4and L4－5in 40 Chinese green goats，included a total of 120 interspace of lumbar vertebrae.Each interspace of lumbar vertebra was randomly implanted with a n HA／PA66 cage combined with one of the following four adenovirus，Adv－BMP9（Adv－BMP9 group，n＝30），Adv－BMP2（Adv－BMP2 group，n＝30），Adv－BMP2－9（Adv－BMP2－9 group，n＝30），and Adv－GFP（Adv－GFP group，n＝30）.The goats were euthanized 24 weeks after operation，and the fusion segment speciments were obtained；radiographic inspection and biomechanical analysis were performed on the segment speciments.Results The X－ray results showed there was no significant difference of disc space height（DSH）before and after operation between various groups.The interbody fusion rates were 70%（21／30）in Adv－BMP2－9 group and 53%（16／30）in Adv－BMP9 group and 31%（5／16）in Adv－BMP2 group and 30%（9／30）in Adv－GFP group.CT fusion degree tests showed that CT fusion scores in Adv－hBMP2－9 group，Adv－h BMP9 group，Adv－hBMP2 group and Adv－GFP group were 52.29±0.72，44.02±0.67，38.83±0.86，and 28.65±0.47，respectively；there were significant differences between various groups（P ＜0.05 or P ＜0.01）.Biomechanical analysis showed that the stiffness of the fusion segment in Adv－BMP2－9 group was higher than that in Adv－BMP9 group（P＜0.05），and stiffness in the fusion segment in Adv－BMP9 group was higher than that in Adv－BMP2 group，but there was no significant difference（P＞0.05）.During the experiment，no local or distant infection，fever，and foreign body rejection were observed in all goats.Conclusion The interbody fusion effect of co－expressing Adv－BMP2－9 combined with n HA／PA66 cage is superior to Adv－BMP9 or Adv－BMP2 on goat lumbar，and BMP2 and BMP9 have collaborative osteogenesis.

bone morphogenetic protein；recombinant adenovirus；interbody fusion；nano－hydroxyapatite；polyamide

R681.5

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1086－05

2012－03－03

国家 “863”计划资助课题（2008AA02Z443）；重庆市卫生局科研基金资助课题（2011－1－053）

马金梁（1978－），男，湖北省荆州市人，讲师，医学博士，主要从事脊柱微创外科方面的研究。

邓忠良（Tel：023－63693138，E－mail：deng7586＠gmail.com）