曲霉型豆豉优势菌株筛选与鉴定

管泳宇，吴满刚，葛庆丰，于 海，汪志君

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州225127)

豆豉自先秦时起源距今已有两千多年的历史。豆豉具有很高的营养价值［1］，可以药食兼用，还具有驱寒健食等功效［2］。根据主要制曲微生物的不同，可以分为毛霉型、曲霉型和细菌型豆豉。目前，豆豉的生产仍然以完全靠经验制作的自然发酵为主，无法采用合理有效的方法对产品的质量进行控制;此外，自然发酵有可能因腐败菌和病原菌带来卫生和安全的隐患［3］。为了控制发酵，实现生产的工业化，必须用纯种发酵代替自然发酵。无论是我国的酱油，还是日本的纳豆［4］、豆酱和印尼的天培［5］，都是在纯种发酵的前提下实现工业化的。豆豉生产过程中制曲工序主要产生丰富的酶系，因此制曲微生物的发酵特性和产酶特性非常关键［6－7］。就曲霉型豆豉而言，霉菌及部分细菌(如芽孢菌、葡萄球菌)生产胞外蛋白酶并直接作用于大豆蛋白［8］，将大分子蛋白质水解成小分子肽类以及游离态氨基酸，这些既具有很强的生物活性又易为人体消化还对风味的产生有积极作用;乳酸菌能降低体系酸度，产生特有风味;酵母菌无氧发酵分解大分子物质的同时产生乙醇，乙醇能够与酸类物质产生酯类物，对风味的形成有很大贡献［9］。本实验旨在对自然发酵豆豉中的微生物进行分离、筛选、鉴定，为豆豉工业化、可控化、标准化生产打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆豉 自然发酵豆豉;蛋白胨、牛肉膏、酵母膏 生化纯;SDS、羟甲基纤维素钠、琼脂糖等 分析纯。

eps300电泳仪 上海UNICO;高速冷冻离心机5804R 北京艾泽信科技有限公司;分光光度计WFJ2000 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株分离纯化 取2g豆豉样，以无菌水定容至10mL，于摇床以120r/min浸提30min。取此溶液梯度稀释 10－4～10－8，后取稀释液 200μL 涂布于不同培养基(见表1)，挑取单菌落划线培养(不同菌种使用不同培养基，如表1)，重复划线培养2～3次，得到微生物单菌落。

1.2.2 霉菌鉴定 先根据菌株的菌落形态和菌丝形态，将分离得到的菌株中毛霉和曲霉区分开，然后按曲霉在PDA、CYA和CA培养基上的菌落形态对其进行初步分类，最后按类别取有代表性的菌株，进行鉴定［10］。

1.2.3 霉菌筛选 采用双层琼脂平板法(PDA双层酪蛋白选择培养基)以产生透明圈的大小作为筛选标准对初筛得到的菌株蛋白酶活力初筛。将6株活性较大的菌株进行蛋白酶活力测定，选出活力最大的菌株。

表1 发酵豆豉中各种菌的培养基及培养条件Table 1 The media and condition of traditional fermented Dou－chi

样品处理:于PDA液体培养基摇瓶培养菌株，培养时间2d，取培养液进行酶活力测定。蛋白酶活力测定采用 Folin法［11］，纤维素酶活力测定使用Matsuura and Obata 的方法［12］。

1.2.4 细菌筛选 根据备选菌株发挥的不同作用，参照发酵剂必须具备的特征，建立相应筛选体系，见表2。

表2 备选发酵菌株的筛选实验设计Table 2 Design of screening test of pre－selceted strains

蛋白提取物降解能力测定:参照汪家政与范明［13］的方法，并加以改进。浓缩胶为4%，分离胶为15%。上样:将两样品浓度调至1mg/mL且与5倍浓度样品缓冲液(含60mmol/L Tris，2%SDS，14.4mmol/L巯基乙醇、25%甘油，用4mol/L盐酸调pH至6.8，加入0.1%溴酚蓝)按体积比4∶1混合，煮沸10min，上样量均为10μL。电泳:起始电压80V，样品进入分离胶后电压调至150V。染色:加入考马斯亮蓝R－250染色液(甲醇∶冰醋酸∶水 =45∶10∶45，并加入 0.2% 考马斯亮蓝R－250)，混合染色40min。脱色:水洗凝胶，加脱色液(甲醇∶冰醋酸∶水 =5∶5∶40)于摇床脱色。

1.3 筛选菌株分子鉴定

1.3.1 总DNA提取 破壁:收集霉菌生长3d菌丝，无菌水洗涤后挤干水分，液氮研磨;取2mL酵母菌生长1d菌悬液无菌水洗涤后离心去上清，沉淀用567μL TE缓冲液重悬加入酸洗玻璃珠破壁;取2mL细菌生长2d菌悬液无菌水洗涤后离心去上清，沉淀用567μL TE缓冲液重悬，加入40μL 10%SDS和10μL 20mg/mL蛋白酶以及10μL 20mg/mL溶菌酶，37℃处理2h。DNA 提取:加入100μL 5mol/L NaCl，再加入 80μL CTAB/NaCl，混匀，65℃ 温育 10min后加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5min，保留上清。上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，10000r/min 离心 5min，保留上清。加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，10000r/min离心5min，收集DNA沉淀，用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。用50μL TE缓冲液溶解DNA，加入终浓度为20μg/mL RNaseA，4℃保存。

1.3.2 鉴定 分别对霉菌进行ITS rDNA鉴定、酵母进行26S rDNA鉴定、细菌进行16S rDNA鉴定［14］。不同菌株使用的不同引物。真菌:上游引物5'－TCC GTA GGT GAA CCT GCG G－3'，下游引物 5'－TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC－3';酵母:上游引物 5'－GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG－3'，下游引物 5'－GGT CCG TGT TTC AAG ACG G－3';细菌:上游引物5'－AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－3'，下游引物 5'－AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA－3'。

1.3.3 PCR反应体系建立 PCR反应体系包括:10×PCR 缓冲液5μL，dNTP 1μL，两端引物的终浓度均为0.2μmol/L，模板 DNA 为200ng，Taq聚合酶2U，用ddH2O将体系调整至50μL。PCR反应条件为:95℃预变性 5min，94℃变性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min。反应结束后取3μL PCR产物经浓度为15mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测。后送样至上海生工测序部测序。

1.3.4 系统发育树的构建 利用NCBI中的Blast对DNA序列进行对比分析，用构建系统发育树。自GenBank下载的菌株如下:JQ02379 Staphylococcus Xylosus、HM854231 Staphylococcus Xylosus、FJ210844 Staphylococcus Saproph、HQ449670 Lactobacillus Fermentu、DQ309297BacillusMojavensis、JQ653051 Bacillus Subtilis、AY267821 Pichia Ohmeri、AF548064 Aspergillus Niger、JQ619849 Aspergillus Niger、HQ285580 Aspergillus Oryzae、HQ285576AspergillusOryzae。 用Mega软件［15］以 Maximum Likehood 法绘制系统发育树，以Bootstrap对系统树进行检验1000次重复。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

豆豉发酵过程分离得到58株曲霉、7株毛霉;得到328株单菌株，经革兰氏染色和显微镜观察，筛选出革兰氏阳性的纯菌株279株，不产生溶血圈、血浆凝固酶阴性的菌株206株，注射菌液的实验小鼠无不良反应［16］，表明所筛菌为非致病性菌株。

2.2 霉菌优势菌种鉴定与筛选

2.2.1 霉菌优势菌种鉴定 豆豉曲中曲霉的种类如表3。

A5号菌株的菌落形态如图1及表3所示。其菌丝形态为:分生孢子头球形直径100～300μm，孢梗径1000～3000μm，直径 5～15μm;顶囊呈烧瓶形或近球形20～40μm;产包结构单层或双层;分生孢子近球形，直径5μm，壁光滑。初步鉴定为:环绕亚属，黄绿组，米曲霉原变种(Aspergillus oryzae)。

A41号菌株的菌落形态如图2及表3所示。其菌丝形态为:分生孢子头球形直径150～500μm，分生孢子梗于基质产生，孢梗茎 1000～4000μm，直径10～20μm;顶囊球形，直径40～80μm;产包结构双层;分生孢子球形，直径3～8μm，壁粗糙。初步鉴定为:环绕亚属，黑色组，黑曲霉(Aspergillus niger)。

2.2.2 曲霉筛选 以菌株产蛋白酶活力大小，对经鉴定无毒的黄曲霉(米曲霉)菌株进行筛选。首先使用双层琼脂平板法筛选出蛋白酶活力较大的6株菌。蛋白酶解圈直径大小:A2为(1.4±0.1)cm、A3为(1.2±0.1)cm、A5为(1.8±0.15)cm、A17为1.4cm、A23为(1.45±0.5)cm、A35为(1.45±0.5)cm。后对这6株菌株进行蛋白酶活测定，筛选出蛋白酶活力最高的菌株。结合图3与图4，可得菌株A5具有较高的蛋白酶活力，可作为复合菌剂发酵菌株，其蛋白酶活力为355U/g。黑曲霉因与米曲霉产生拮抗作用且产蛋白酶量较米曲霉低，故不作继续筛选。

表3 豆豉曲中的曲霉种类Table 3 Aspergillus Molds in douchiqu

图1 A5菌丝及菌落形态Fig.1 Hyphae and colony morphology of A5

图2 A41菌丝及菌落形态Fig.2 Hyphae and colony morphology of A41

图3 不同菌株蛋白酶水解圈对比Fig.3 The circle of enzymatic hydrolysis of protein of strains

2.3 细菌筛选

2.3.1 细菌初筛 分离菌株初筛结果见表4。

由表4可知，经初筛得出17株乳酸菌、5株葡萄球菌、3株芽孢杆菌和1株酵母符合筛选指标的要求，可作为发酵的目标菌株。

图4 不同菌株蛋白酶活力值比较Fig.4 The activity of protease of strains

2.3.2 乳酸菌复筛 将17株菌接于脱脂乳，42℃培养，取凝乳时间较短的5株菌接入经过前发酵的黑豆中进行产酸测定。酸度测定值如图5所示。

表4 分离菌株初筛结果Table 4 The fermented characters of one－step selected strains

图5 复筛菌株产酸比较Fig.5 The acid－producing of selected strains

由图5可见，5株乳酸菌产酸趋势相近，但其表现出不同的酸度变化。0～8h时，菌株产酸较低且产酸率较低;8～18h时，菌株产酸增加较快且产酸率较大;18～22h，菌株进入稳定期，酸度停止增加。达稳定期时，菌株M59酸度最高且酸度达平衡时间最快，可作为发酵的目标菌株，其发酵20h终酸度66°T。

2.3.3 芽孢杆菌复筛 对经初筛的芽孢杆菌进行蛋白酶活力与纤维素酶活力测定，结果如图6所示。

结果显示，蛋白酶活最高的菌株为M231，M253次之，前者较后者高6.8%;纤维素酶活最高的菌株为M253，M231次之，前者较后者高27.2%。比较酶活差距，选择M253为发酵的目标菌株，其纤维素酶活为47U/g、蛋白酶活为140U/g。

图6 芽孢杆菌蛋白酶活力与纤维素酶活力Fig.6 The activity of protease and bacillus of strains

2.3.4 葡萄球菌复筛 所选菌株对经前发酵处理过的大豆蛋白降解图谱见图7。

图7 不同菌株处理后发酵大豆蛋白SDS－PAGE电泳图Fig.7 SDS－PAGE of soy proteins hydrolysis by strains

由图7可知，将不同的菌株接种到经前发酵处理的大豆蛋白提取物中，37℃发酵5～6d，和对照组CK相比，接种M101的蛋白分子量为45ku和31ku的条带发生降解变淡;接种M184的蛋白降解情况相似，其分子量在31ku以上的蛋白条带均发生明显的降解;接种M21的肌原纤维蛋白降解情况最为明显，大于31ku的大分子蛋白质片段明显减弱，而14.4～20ku区域条带降解不明显，推测为生成14～20ku之间的小分子片段，20ku处的蛋白条带也发生明显的降解。综合菌株对蛋白的降解情况，最终选择菌株M21作为发酵的目标菌株。

2.4 筛选菌株分子鉴定

2.4.1 PCR扩增片段结果 筛选菌株DNA提取结果如图8所示，筛选菌株PCR结果如图9。

图8 提取的DNA电泳结果Fig.8 Gel electrophoresis results of DNAs

图9 DNA的PCR电泳结果Fig.9 Gel electrophoresis results of PCR of DNAs

用1%(W/W)的琼脂糖凝胶电泳对菌株的总DNA和PCR扩增产物作电泳检测，溴化乙锭染色后通过凝胶成像系统观察并照相。从图8看出，在大分子量区域出现明显荧光条带。因提取量较大且菌体使用液氮研磨，故有一定的拖尾现象，但不影响其后续PCR操作，能满足16S rDNA扩增和测序的需要。如图9知，曲霉A5、A41在600～700bp处出现荧光条带，酵母A71在600bp处出现荧光条带，细菌M21、M59、M253在1500bp左右出现荧光条带;与实验设计相符，且条带亮度高无拖尾，能满足后续序列测定的需要。

2.4.2 测序及系统发育树的构建 基因序列分析显示，真菌A5、A41、A71 PCR产物基因序列长度分别为 622、619、593bp。细菌 M21、M59、M253 PCR 产物基因序列长度分别为 1432、1453、1411bp。A5、A41、A71、M21、M59、M253 于 Genbank 登录号分别为:JX393053、 JX393054、 JX393055、 JX393056、JX393057、JX393058。将序列与 GenBank中相关菌株的对应序列进行比较，系统发育树如图10所示。

图10 采用Maximum Likehood法构建的菌株系统发育树Fig.10 The phylogentic tree based on rDNA sequence using Maximum Likehood methods

由图10可得，M21与木糖葡萄球菌JQ023729的支持率为90%，M21、JQ023729与木糖葡萄球菌HM854231的支持率为99%，证明此菌株为木糖葡萄球菌。类似分析可得:M59为发酵乳杆菌、M253为枯草芽孢杆菌、A71为毕赤酵母、A41为黑曲霉、A5为米曲霉。

3 讨论

豆豉的生产分为前酵(制曲)和后酵两个阶段。豆豉制曲期间在霉菌的作用下，氨基酸态氮以及蛋白酶酶活随着制曲时间的进行而增加，后到达某一值时开始降低。后发酵期间由于枯草芽孢杆菌对应的需氧型发酵，使得体系中氧气迅速减少，且枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶与纤维素酶帮助分解大分子物质产生特有的风味［17］;乳酸菌进一步分解大分子物质，产生的物质犹以酸居多;酵母菌无氧发酵分解大分子物质的同时产生乙醇，乙醇能够与酸类物质产生酯类物［18］。菌株的共同作用形成了豆豉特有的风味。本研究根据不同菌株的发酵特性对豆豉发酵过程中优势菌株进行筛选，后对菌株进行分子检测，初步确定菌种科属。在我国，曲霉型豆豉的制作由于参加发酵的菌种多、发酵过程变化大、没有明确菌体的菌种，生产过程及发酵均难以控制且存在一定的安全隐患，故明确豆豉发酵菌种，并利用豆豉中优良菌种进行豆豉制作具有重要意义。

4 结论

本研究对曲霉型豆豉发酵优势菌株进行筛选。初筛获得真菌3种、细菌3种。复筛以蛋白酶活力为指标筛米曲霉、以产酸率为指标筛选乳酸菌、以蛋白酶与纤维素酶活力为指标筛选芽孢杆菌、以蛋白降解能力为指标筛选葡萄球菌。筛选得到:A5蛋白酶活355U/g、M59 发酵 20h 终酸度66°T、M253 纤维素酶活47U/g、蛋白酶活140U/g、高蛋白降解率菌株M21。对筛选菌株进行分子鉴定、构建进化树。鉴定得到:A5为米曲霉、A41为黑曲霉、M21为木糖葡萄球菌、M59为发酵乳杆菌、A71为毕赤酵母、M253为枯草芽孢杆菌。

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