超高压加工对菊糖果糖转移酶活力和构象的影响

刘 苗，缪 铭，张 涛，张 瑜，江 波

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

超高压加工(High Pressure Processing，HPP)技术是一种新型非热加工技术，可应用于食品杀菌、钝酶及食品保鲜等方面［1－2］，还可应用于蛋白质和淀粉等生物大分子的结构研究［3］。随着超高压加工在理论和技术方面研究的不断深入，有关压力处理对酶影响的研究越来越多。相关研究表明超高压加工不仅能钝化酶，也可将酶激活并提高酶的稳定性和活力［4］，但国内外当前对超高压在激酶方面研究还相对较少。一般低压(小于300MPa)处理对酶有激活作用(激酶效应)，高压(大于300MPa)可钝化酶［5］。低压可使维持酶二级和三级结构的各种非共价键(如氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用等)更稳定或使酶活性位点发生变化而有利于底物的结合，而高压可破坏酶的各种非共价键导致酶构象改变，酶活力随之改变［6］。菊糖果糖转移酶(Inulin Fructotransferase，即 IFTase，EC4.2.2.18)能从菊糖的非还原性末端裂解出两分子果糖并使其脱水形成类环状二糖酐——双果糖酐III［7］。双果糖酐III(Difrucose anhydride III，DFA III)是一种新型的天然功能性甜味剂。国内当前仅有本实验室对A.aurescens SK8.001产菊糖果糖转移酶的酶学性质及分子生物学方面和DFA III酶法合成进行了研究［7］。由于适当的提高压力对菊糖果糖转移酶有激活作用，因此本研究以菊糖果糖转移酶为研究对象，运用荧光光谱和圆二色谱等方法研究压力处理后菊糖果糖转移酶构象的变化，并结合酶活力的变化，分析压力处理后的酶构象变化与酶活力大小之间的联系，为超高压加工技术在激酶方面的研究提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

菊糖果糖转移酶 实验室自制;DFA III标准品 和光纯药工业株式会社;菊糖 比利时Beneo－Orafti公司。

超高压仪器 S－FL－085－09－W 英国 Stansted Fluid Power公司;高效液相色谱仪Agilent 1100 美国安捷伦公司;圆二色谱仪MOS－450 AF－CD 法国Biologic公司;荧光光谱仪F－7000 FL 日本Hitachi公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菊糖果糖转移酶活力检测 菊糖2%1mL，100mmol/L、pH5.5醋酸钠缓冲液和适量的酶液，总体积2mL，60℃水浴 15min后，沸水浴 10min灭酶。HPLC法测定DFAⅢ的生成量(Sugarpak1钙型阳离子交换柱;柱温:85℃;流动相:超纯水(经0.22μm膜过滤);洗脱流速:0.4mL/min;上样体积:10μL;检测器:示差折光率检测器)。

酶活定义:在 60℃，pH5.5条件下，1min产生1.0μmol DFAⅢ所需的酶量为 1个酶活力单位(U/mL)。未经处理的原酶液(未处理组)的相对酶活力为100%。

1.2.2 不同压力对菊糖果糖转移酶的影响 在80℃条件下，将酶液分别在 0.1、100、150、200、250、300、350、400MPa下处理10min，卸压后立即进行光谱检测及酶活力测定。

1.2.3 不同保压时间对菊糖果糖转移酶的影响 在80℃条件下，将酶液在0.1MPa和200MPa下分别处理 10、20、30、40、60min，卸压后立即进行光谱检测及酶活力测定。

1.2.4 荧光光谱检测 激发波长为286nm，扫描范围300～400nm，扫描速度为12000nm/min，狭缝宽度为5nm，PMT电压为400V，室温下重复扫描3次。空白为100mmol/L、pH5.5的醋酸钠缓冲液，荧光强度值为扣除空白后的相对值。未处理组的相对荧光强度为100%。

1.2.5 圆二色谱检测 以100mmol/L、pH5.5醋酸钠缓冲液为空白，比色皿厚度0.1cm，扫描范围190～250nm，室温下重复扫描3次，扫描速度30nm/min。圆二色性用平均残基椭圆值［θ］·10－5表示，单位为deg·cm2/dmol。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱分析

在酶蛋白分子中，色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及苯丙氨酸(Phe)这三种芳香族氨基酸由于侧链生色基团的不同而有不同的荧光强度，Phe、Tyr、Trp的相对荧光强度分别为0.5、9和100，而Phe残基在一般情况下很难被激发，因此酶的内源荧光主要由Trp和Tyr产生。Tyr荧光光谱最大发射波长一般位于303nm左右，由于Trp残基对微环境的变化很敏感，导致其峰位多在325～350nm之间变动［8］。菊糖果糖转移酶是一种单体酶，其氨基酸序列中有9个Tyr残基和2个Trp残基。压力处理通过影响非共价键可改变酶的三级结构，现运用内源荧光光谱来研究压力处理后酶三级结构的变化。

如表1所示，当激发波长为286nm时，压力处理前后的酶最大发射峰位在343～353nm范围内变动，这表明菊糖果糖转移酶的内源荧光主要来自Trp残基，这可能是由于酶分子的Tyr残基到Trp残基之间发生了能量转移，从而导致Tyr残基的荧光淬灭和Trp残基的荧光增强［9］，由此推断菊糖果糖转移酶属于B类蛋白，其内源荧光光谱实际上是Trp残基的荧光光谱。压力处理后的酶结构变化运用酶内源荧光光谱检测，即表现为压力处理后Trp残基微环境变化。

表1 不同压力对菊糖果糖转移酶荧光峰位及荧光强度和酶活力的影响Table 1 Effect of different pressure on the fluorescence peak/intensity and IFTase activity

未经处理的原酶液(未处理组)的最大发射峰位在343.4nm，最大荧光强度为531.4，经常压80℃处理后，与未处理组相比，酶活力和荧光强度均降低了12%左右。但经100、150、200MPa的压力处理后其相对酶活力分别提高了8%、5%和9%，这表明适当的提高压力不仅可抵抗酶的热失活，而且使酶的催化活力增强，其原因是高温使酶分子结构变的不稳定而导致酶活降低，而压力处理能维持酶结构的微观有序性［10－11］，使酶结构趋于稳定以抵抗酶的热失活;同时，荧光峰位发生一定程度的红移，最大发射峰的波长增大了2～3nm，与未处理组相比，最大荧光强度增加了1%左右，表明压力处理后酶结构的变化导致一定数量的Trp残基外露，导致荧光峰位红移和荧光强度增强，因而可以利用荧光强度和峰位的变化的来反映压力引起的Trp残基微环境的变化。随着压力的继续增大，峰位的红移也更加明显，但酶活力和荧光强度均逐渐降低，当压力达到400MPa，酶活仅残余7.8%，最大峰位红移约10nm，相对荧光强度仅有66.88%，这表明过高的压力(大于300MPa)明显破坏了该酶的三级结构，使酶严重失活。如图1所示，各压力处理后的相对酶活力和相对荧光强度之间呈较好的线性正相关(R2=0.9896)。以上结果表明酶活力变化与压力引起的Trp微环境的变化有紧密联系。

图1 各压力(100～400MPa)处理后的相对酶活力与相对荧光强度之间的相关性Fig.1 Correlation between relative enzyme activity and relative fluorescence intensity under different pressure(100～400MPa)

由表2分析可知，200MPa下，随着保压时间的延长，酶活逐渐升高，在保压30min时相对酶活力达最大，为124.08%，继续延长保压时间，酶活又逐渐降低，当保压时间为 60min时，相对酶活力仅有73.27%。与酶活力随保压时间变化的趋势类似，荧光强度也是随着保压时间的延长先升高再降低。其原因可能是压力处理足够的时间所带来的能量可导致维持酶蛋白分子结构的一些相互作用力(如氢键作用、疏水性作用、范德华力等)发生适当的变化，这些变化导致酶三级结构的变化［12］进而荧光强度增强和酶活力提高;但过长的保压时间会使过量的水分子渗透到酶分子内部，导致非极性基团的接触减少而引起酶结构部分展开［12］，酶活力和荧光强度随之降低。

表2 不同保压时间对菊糖果糖转移酶荧光峰位及荧光强度和酶活的影响Table 2 Effect of different dwell time on the fluorescence peak/intensity and IFTase activity

如图2所示，压力处理后菊糖果糖转移酶的相对酶活力与相对荧光强度之间呈较好的线性正相关(R2=0.9976);而随着常压高温处理时间的延长，相对酶活力逐渐降低，荧光强度则逐渐升高，其相对酶活力与相对荧光强度之间呈线性负相关(R2=0.9328)。Mozhaev等［13］认为酶热失活的初始步骤是必要水分子的大量流失而导致结构重排，适当的压力处理则通过电荷基团和非极性基团的水化作用来阻止这一过程，过高的压力会迫使水分子进入蛋白质分子内部而引起蛋白质的部分展开。这表明虽然高压和高温处理都可改变酶的三级结构，但其机理明显不同。

图2 200MPa/0.1MPa处理不同时间后的相对酶活力与相对荧光强度之间的相关性Fig.2 Correlation between relative enzyme activity and relative fluorescence intensity at different time under 200MPa/0.1MPa

2.2 圆二色谱分析

由于包含发色团的酶蛋白分子的不对称性，引起左右两圆偏振光具有不同的光吸收的现象，即圆二色性(circular dichroism，CD)，常用于溶液中酶二级结构的研究。

运用圆二色谱分析压力对菊糖果糖转移酶二级结构的影响，结果如图3所示。未经处理的菊糖果糖转移酶的圆二色谱在219nm左右单有一个负峰，表明菊糖果糖转移酶的二级结构以β－折叠为主。经压力(100～400MPa)处理后，负峰的峰型和峰位基本未变(见图3和表3)，说明在实验压力处理后菊糖果糖转移酶的主体二级结构未发生很明显变化。有文献报道［14］酶二级结构的改变发生在非常高的压力条件(高于300～700MPa)下，还依赖于压缩速率和二级结构重排的程度，而这可导致酶的变性。本研究是在压力(100～400MPa)处理后检测酶二级结构的变化，实验结果出现负峰值随压力的升高而逐渐升高，说明其二级结构发生了微小的变化，但当处理压力大于300MPa，即使是这微小的变化也会导致酶的严重失活。在100～400MPa的压力范围内酶活力与219nm负峰值大小呈线性负相关(R2=0.9659)，如图4，表明β－折叠是菊糖果糖转移酶发挥催化活力的结构基础。

图3 各压力处理后的菊糖果糖转移酶的圆二色谱图Fig.3 CD of the IFTase under the different pressure

表3 不同压力对菊糖果糖转移酶圆二色性和酶活力的影响Table 3 Effect of different pressure on circular dichroism and IFTase activity

图4 各压力(100～400MPa)处理后的相对酶活力与219nm处的负峰值之间的相关性Fig.4 Correlation between relative enzyme activity and value of the negative peak at 219nm under different pressure(100～400MPa)

图5 不同处理时间后的菊糖果糖转移酶的圆二色谱图Fig.5 CD of IFTase under the different dwell time

由图5(a)可知，与未处理组相比，219nm处的负峰值随保压时间的延长逐渐增大，相对酶活力则呈先上升后下降的趋势，200MPa处理30min可使酶活提高最多(见表4)，而此时酶的二级结构与酶在自然状态下的二级结构不同。处理时间超过30min后，酶活则开始降低，且219nm处的负峰值变化较大，这表明保压时间过长使酶二级结构发生的变化可导致酶活降低。图5(b)是常压80℃处理10～60min后酶的圆二色谱图，由图可知，219nm处的负峰值变化不大，但酶活力损失较多，说明高温处理10～60min可能对该酶的二级结构影响不大，而酶的部分热失活可能与酶的三级结构(由酶的荧光光谱的结果可知)被破坏有关。

表4 不同保压时间对菊糖果糖转移酶圆二色性和酶活的影响Table 4 Effect of different dwell time on circular dichroism and IFTase activity

3 结论

在80℃的条件下，压力处理后的菊糖果糖转移酶的相对酶活力均随着压力的升高和保压时间的延长呈先上升后下降的趋势，在压力为200MPa、保压时间为30min时相对酶活力达最大，表明适当的压力处理能增强酶的催化活力。菊糖果糖转移酶的内源荧光吸收主要来自Trp残基，并结合压力处理后该酶的相对酶活力和相对荧光强度之间呈线性相关的分析，可知酶活力变化与压力处理后Trp微环境的变化有一定联系。由圆二色谱的结果可知β－折叠是菊糖果糖转移酶的主要二级结构，219nm处的特征负峰值大小与相对酶活力呈负线性相关，表明β－折叠是该酶发挥催化活力的结构基础。超高压加工可提高菊糖果糖转移酶活力，与压力处理后酶二级和三级结构的变化有关，为超高压加工提高酶活力的机理研究提供一定的理论依据。

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