一株耐高温乳酸菌的发酵条件优化

王玉，吴疆，吴家鑫

（1.天津农学院农学系，天津 300384；2.中牧实业股份有限公司兽药研究所，北京 100091）

乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，是重要的生物化工产品，在医药、食品等工业有广泛的应用[1]。它也是制造无毒的高分子化合物聚L-乳酸的单体，且聚L-乳酸具有良好的生物相容性，强度高，可塑性加工成型，不污染环境因而被认为是最有前途的可生物降解高分子材料[2]。在乳酸发酵工业中，利用高温乳酸菌可以缩短生产周期、节约冷却用水，减少污染的可能性。

本文将Plackett-Burman设计与Box-Benhnken设计相结合，并运用SAS软件对一株能够耐受55℃高温的乳酸菌发酵乳酸的培养基进行了优化。

1 仪器、材料与方法

1.1 仪器

飞鸽牌系列离心机：上海安亭科学仪器厂；座式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；生化培养箱（55℃）：江苏金坛市宏凯仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；电子天平：梅特勒－托利多仪器(上海）有限公司；旋转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；生物传感分析仪SBA-40C：山东省科学院。

1.2 耐高温乳酸菌LA-55

由天津农学院微生物实验室筛选保藏。

1.3 培养基

斜面培养基（g/L）：葡萄糖 50、蛋白胨 10、酵母膏5、牛肉膏 10、乙酸钠 5、MgSO4·2H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.038、柠檬酸二胺 2、K2HPO42、CaCO317，pH6.5。

种子培养基（g/L）：葡萄糖 30、蛋白胨 10、酵母膏10、牛肉膏 10、乙酸钠 5、MgSO4·2H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.2、柠檬酸二胺 2、K2HPO40.2、CaCO320、吐温 801，pH6.8。

发酵培养基：初始发酵培养基同种子培养基，在优化实验中，各成分的量随设计的不同而不同。

1.4 实验方法

1.4.1 L-乳酸的发酵

将斜面3～4环接于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，55℃下120 r/min培养12 h即为种子液。以10%（体积比）的接种量接种于装50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，55℃，120 r/min摇床培养36 h。发酵培养基成分根据实验方案逐次改变。

1.4.2 分析方法

采用生物传感分析仪。

1.4.3 Plackett-Burman设计

采用Plackett-Burman设计可以在多种因素存在的条件下评价各因素之间的相对重要性[3]。选用实验次数N=12的实验设计，对9个因素进行考察，各因素对应的水平取值见表1。

表1 Plackett-Burman实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design g/L

1.4.4 Box-Benhnken设计

Box-Benhnken中心组合设计是比较常用的响应面分析法（RSA）方法，适用于2至5个因素的优化实验[4]。本实验在P-B实验的基础上，以乙酸钠，酵母膏，蛋白胨3个因素为自变量，设计了三因素三水平响应面分析实验。各自变量的编码值如表2所示。

表2 Box-Benhnken设计因素水平编码表Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken design g/L

2 结果与分析

2.1 L-乳酸发酵主要影响因素的确定

采用Plackett-Burman实验对前期实验筛选出的氮源、碳源和无机盐进行优化，选出对L-乳酸发酵有重要影响的因素，实验方案及结果见表3。

表3 Plackett-Burman实验设计及结果Table 3 The results of Plackett-Burman design

通过SAS软件对实验结果进行分析，各因素主效应分析结果见表4。

表4 各因素的主效应Table 4 Main effect of the factors

乙酸钠在α=0.1水平上对L-乳酸产量有显著影响，其他因素均不显著。综合实验分析，选择排在前三位的乙酸钠、酵母膏、蛋白胨进行下一步实验。

2.2 最适灰树花胞外多糖发酵培养基的确定

2.2.1 Box-Benhnken实验设计及分析

依据P-B实验和最陡爬坡实验确定的实验因素与水平，采用Box-Benhnken实验设计对产灰树花发酵条件进行三因素三水平的响应面分析实验，实验结果见表5。

运用SAS软件的RSREG（响应面回归）过程对数据进行二次回归拟合见表6、表7。由表6可知，该回归模型显著，复相关系数的平方R2=0.9210，因此通过SAS软件分析得出的此回归方程拟合程度较好。方差分析说明，各因素的一次项、二次项显著影响L-乳酸合成，说明响应面分析所选的3个因素（乙酸钠、酵母膏、蛋白胨）主效应显著。失拟检验Pr=0.5038，不显著，说明不需要引入更高次项，模型中无异常点，模型规定恰当。拟合的二次回归方程为：

表5 Box-Benhnken实验设计及结果Table 5 The results of Box-Benhnken design

表6 方差分析表Table 6 The results of variance analysis

表7 回归模型系数估计Table 7 Estimated value of the regression coefficient

2.2.2 响应面直观分析

根据模型方程（回归方程）可以作出响应曲面图及其等高线图。它们可以比较直观地解释各变量和变量之间对响应值的影响。图1所示为蛋白胨（X3）、乙酸钠（X1）和酵母膏（X2）对L-乳酸产量的影响模型的等高线图。

图1 响应面分析的等高线图Fig.1 Response plot

2.2.3 岭脊分析

运用SAS软件对回归模型进行岭脊分析，寻求最大产乳酸量的稳定点及对应的因素水平，结合图1给出回归方程的三维响应面图和等高线图可知，回归模型存在稳定点（－0.047723，0.101134，0.021758），乳酸产量的最大估计值为11.3473g/L。即各因素的真实值分别为：乙酸钠1.69 g/L、酵母膏6.63 g/L、蛋白胨6.33 g/L，该模型预测的最大乳酸产量为11.3473 g/L。通过SAS软件的分析，当乙酸钠1.69 g/L、酵母膏6.63 g/L、蛋白胨6.33 g/L时，回归模型存在稳定点，且为最大值，预测最大L-乳酸产量为11.3473 g/L。

2.2.4 模型验证

由于实验方案中没有最适配方这个组合，需要对最适培养基进行验证实验。验证实验结果表明，其产乳酸量为12.533 g/L，与模型预测相符，可见模型可较好的预测实际发酵情况。从而，确定最适发酵培养基（g/L）：乙酸钠 1.69 g/L、酵母膏 6.63 g/L、蛋白胨 6.33 g/L。比最初的产量7.2 g/L提高了74.07%，表明该模型是合适有效的，并具有一定的实践指导意义。

3 结论

通过SAS软件优化发酵培养基，通过Plackett-Burman实验得出乙酸钠、酵母膏、蛋白胨为影响乳酸产量的显著因素；再经过响应面分析实验得出最优培养基配方：乙酸钠1.69 g/L、酵母膏6.63 g/L、蛋白胨6.33g/L，使L-乳酸产量在55℃条件下由初始发酵条件下的7.2 g/L提高到12.533 g/L，提高百分比为74.07%，优化结果非常显著。

[1]ABDULLATIF T,Shang-tian Yang.Production of L-lactic acid from Glucose and Starch by Immobilized Cells of rhizopus oryzac in a rotating fibrous bed bioreactou[J].Biotechnology and bioengineering,2002,80(10):1-12

[2]徐忠,汪群慧,姜兆华.L-乳酸的制备及其应用的研究进展[J].化学与粘合,2004,214(4):214-217

[3]疏秀林,施庆珊,冯静,等.γ-聚谷氨酸发酵培养基的Plackett-Burman法优化[J].生物技术通报,2007(4):173-177

[4]Barry D Greig,Gerald A Payne.Epimerization of lactose to free lactulose in heated modes milk solutions[J].Journal of dairy research,1985,52(3):409-417