针刺对戊四唑致痫大鼠海马神经元超微结构的影响*

昂文平 杨 帆 沈德凯 刘向国

（安徽中医学院，安徽 合肥 230038）

癫痫是一组由不同病因所引起的脑神经元高度同步化异常放电所致。癫痫反复发作可导致脑神经元损伤，甚至死亡［1］。我们以往的研究表明针刺具有明显的抗癫痫作用［2］。近来，临床与实验研究表明针灸对中风病具有很好的脑神经元保护作用［3］。为此，本实验通过建立戊四唑诱发大鼠癫痫模型，给予针刺治疗，通过HE染色和电镜观察癫痫大鼠海马区病理改变及神经元超微结构变化，探讨针刺对大鼠癫痫发作继发脑神经元损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康SD大鼠72只（安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：皖医实动准字第070211号），体质量约300 g。随机分为3组：模型组、针刺组、正常组，每组24只，分别于癫痫发作后4 h与24 h两个时间段取材，每个时间段取12只大鼠，其中6只用4%多聚甲醛内固定后取脑用于制作石蜡切片；另6只大鼠取活体海马组织作电镜观察。

1.2 药物与试剂 戊四唑，美国Sigma公司产品，用前以0.9%氯化钠注射液配制成质量浓度为5 mg/mL的溶液，4℃保存备用。

1.3 模型制备［4］采用戊四唑50 mg/kg腹腔注射造成急性癫痫发作模型。正常组大鼠腹腔注射2 mL 0.9%氯化钠注射液。

1.4 针刺方法 将大鼠放置在特制的高台上，选用1寸28号毫针，针刺百会、大椎穴［5］，每5分钟以左右捻转手法行针1次，30 min后取针，结束治疗。

1.5 标本采集与检测 （1）大鼠经10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射深度麻醉，待翻正反射消失以后，按常规方法4%多聚甲醛左心灌注固定取脑。用刀片切去小脑并于视交叉前切去大脑，置入上述相同固定液中固定24 h，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，于海马部位制成厚约5μm的石蜡切片，HE染色，400倍光学显微镜下观察并摄片。（2）取活体大鼠海马组织CA3区1 mm3大小，固定于2.5%戊二醛4～6 h后，将组织固定于1%锇酸1 h，30%、50%乙醇脱水后放入70%醋酸铀乙醇饱和液中12 h，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，表于铜网上，醋酸铀、枸橼酸铅染液，透射电镜观察并摄片。

2 结 果

2.1 HE染色结果 正常大鼠海马CA1区、CA3区锥体细胞排列整齐，结构完整，光镜下观察，胞浆透明，细胞核呈圆形或椭圆形，核居中，大而圆，染色质分布均匀，核仁清晰，形态正常，核周间隙正常。模型组大鼠癫痫发作4 h后，海马CA3区锥体细胞呈散在的细胞变性水肿，轮廓模糊、界限不清，细胞间距加大，锥体细胞数量减少，排列紊乱，出现较多受损的异常神经元，海马结构失去完整，并见散在的深染、核固缩神经元，CA1区见少量神经元坏死、锥体细胞排列不整齐但程度较CA3区轻。癫痫发作24 h后，海马CA1区和CA3区锥体细胞层神经元稀疏，排列紊乱，神经元形态不完整，细胞肿胀或皱缩、轮廓模糊、界限不清，细胞间距加大。见图1。

图1 模型组4、24 h脑组织海马切片（HE染色，×400）

针刺组在癫痫发作4 h大鼠海马CA1区、CA3区神经元较稠密，排列整齐，细胞有轻度水肿，细胞间距变化不明显，受损的异常神经元均较少；癫痫发作24 h大鼠海马CA1区、CA3区神经元排列尚整齐，水肿、固缩不明显，仅散在少量的变性坏死神经元。见图2。

图2 针刺组4、24 h脑组织海马切片（HE染色，×400）

2.2 海马神经元超微结构观察 电镜下可见正常组大鼠海马神经元超微结构正常，核呈椭圆形，核膜完整清晰，染色质分布均匀，常染色质丰富，核仁较明显，呈海绵状，胞浆内粗面内质网，线粒体、高尔基体，核糖体均较发达，线粒体结构清晰完整。

模型组癫痫发作4 h后大鼠海马神经元即出现损伤，超微结构观察核膜不清晰，部分神经元表现为核固缩，线粒体膜不完整，断裂；24 h后海马神经元损伤加重，神经元核膜不清晰，核固缩，染色质边集，线粒体膜断裂，基质消失，出现明显空泡化，伴内外膜的崩解，出现巨大线粒体，并有髓样小体形成，部分胶质细胞空化、肿胀，细胞器稀疏，结构破坏，高尔基复合体囊泡和内质网肿胀，并观察到凋亡细胞。见图3。

图3 模型组大鼠海马CA3区神经元电镜图

针刺组大鼠海马神经元损伤明显减轻，其中4 h时间段神经元出现核膜较完整，异染色质稍增多，线粒体轻微肿胀；24 h时间段神经元核膜完整，粗面内质网较丰富、增宽不明显，线粒体结构正常。见图4。

图4 针刺组大鼠海马CA3区电镜图

3 讨 论

研究显示一次癫痫的急性发作就足以引起边缘叶特定区域神经元的脱失［6-7］，由于癫痫的病程具有慢性和反复性的特点，因此上述病理损害会重复发生并不断叠加。近年来对癫痫造成的脑损害研究成为重要的研究课题，临床、病理和神经影像学都揭示了癫痫持续状态可以造成严重的脑损害，尤其是海马区的硬化，并直接导致癫痫反复发作［8］。本研究利用HE染色和电子显微镜技术对大鼠急性癫痫发作后4 h和24 h两个时间段海马的形态学研究表明：急性癫痫发作后4 h大鼠海马神经元出现形态学改变，光镜下见锥体细胞轮廓模糊、界限不清，细胞间距加大，细胞数量减少，排列紊乱，出现受损的异常神经元，海马结构失去完整，并见散在的深染、核固缩神经元；电镜下见核膜不清晰，部分神经元表现为核固缩，染色质，线粒体膜不完整，断裂。24 h后光镜下见锥体细胞变性、丢失加重，特别是门区、CA1和CA3区出现大量深染、固缩神经元，锥体细胞稀疏；电镜下见核膜不清晰，核固缩，染色质边集，线粒体膜断裂，基质消失，出现明显空泡化，伴内外膜的崩解，出现巨大线粒体，并有髓样小体形成，部分胶质细胞空化、肿胀，细胞器稀疏，结构破坏，高尔基复合体囊泡和内质网肿胀。本研究显示大鼠海马结构在癫痫发作4 h即出现神经元变性脱失现象，随时间推移神经元脱失明显加重，此结果与他人研究相符［4，9］。针刺具有保护癫痫继发脑损伤作用，实验显示针刺4 h，HE染色结果显示针刺组大鼠海马CA1区、CA3区神经元较稠密，排列整齐，细胞仅有轻度水肿，细胞间距变化不明显，受损的异常神经元均较少；针刺治疗24 h后大鼠海马CA1区、CA3区神经元排列仍较整齐，水肿、固缩不明显，仅散在少量的变性坏死神经元。电镜观察也显示：针刺组大鼠海马神经元损伤明显减轻，核膜完整光滑，核仁居中，线粒体结构正常，嵴完整，仅见部分线粒体轻微肿胀，部分高尔基体肿胀，形成囊泡。以上结果从神经元超微结构验证针刺具有保护癫痫继发脑神经元损伤作用。但由于癫痫继发脑损伤的多通路性和针刺作用的多靶点性，针刺保护癫痫继发神经元损伤的具体途径尚不清楚，要想完全揭示针刺保护癫痫继发脑损伤的机理尚需从多途径、多靶点研究。

［1］杨帆，杨永清.癫痫与脑神经元损伤［J］.医学综述，2009，15（19）：2881-2884.

［2］昂文平，杨帆，王频，等.电针对戊四唑点燃型癫痫大鼠脑电图的影响［J］.安徽中医学院学报，2004，23（4）：20-22.

［3］王明山，马福国，陈怀龙.针刺对脑缺血及再灌注损伤保护作用的研究概况［J］.中医杂志，2009，50（11）：1039-1041.

［4］陈琅，邹漳钰，陈新，等.PTZ致痫大鼠海马区神经元损伤的研究［J］.脑与神经疾病杂志，2005，13（3）：200-203.

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