空心莲子草有效部位提取物抗甲型H3N2流感病毒作用*

李 爽，彭晓芝，廖鹏程，陈树和，刘焱文

（湖北中医药大学中药资源与中药化学省级重点实验室，武汉 430061）

空心莲子草[Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb]为苋科（Amaranthaceae）莲子草属（Alternanthera）多年生宿根草本植物，植物资源极为丰富。该中药及其注射剂曾收载于1977年版《中国药典》[1]。空心莲子草具有清热解毒、凉血利尿的功效[1]，用于治疗流行性出血热、流行性感冒等病毒性疾患[2]。现代药理研究表明，空心莲子草提取物具有抗流行性出血热病毒、流感病毒、乙肝病毒、狂犬病毒、疱疹病毒等多种病毒的作用[3-4]。本实验室前期对空心莲子草抗病毒的物质基础进行了系统研究，从中分离和鉴定了86种化合物，并筛选出22种化合物具有抗病毒生物活性，采用大孔树脂中药现代化纯化技术提取了该中药的有效部位提取物。为了验证空心莲子草有效部位提取物的抗病毒生物活性，本实验对该提取物抗H3N2流感病毒的生物活性进行了研究，以期为其开发应用提供依据。

1 材料

1.1 药物 空心莲子草有效部位提取物（由本实验室制得），以二甲基亚砜（DMSO）溶解后再用无血清培养基2稀释成相应浓度的含药无血清培养液。利巴韦林注射液（湖北潜江制药股份有限公司，批号：1101021），用无血清培养基2稀释成相应浓度的含药无血清培养液。

1.2 试剂 小牛血清（Gibco公司产品，批号:16010-159），DMEM（Gibco公司，批号：562979），四甲基偶氮唑蓝（MTT，Amreseo公司产品进口分装，批号：0793），DMSO（国药集团化学试剂有限公司产品，批号：TZO081119），青霉素（华北制药股份有限公司产品，批号：C0808212），链霉素（大连美罗大药厂产品，批号：65080902），胰酶（Amresco公司产品进口分装，批号：1872B82）。

1.3 细胞和病毒 幼犬肾（MDCK）细胞和甲型H3N2流感病毒均由武汉大学医学院病毒学研究所提供。流感病毒H3N2在MDCK细胞上以四甲基偶氮唑蓝（MTT法）[5]测定的半数组组培养感染剂量（TCID50）为10-4，实验中使用的感染剂量为100 TCID50。

1.4 细胞培养基 细胞增殖培养基：含10%小牛血清的DMEM培养基，青霉素、链霉素含量为100μg/mL。无血清培养基1：含青霉素、链霉素100 μg/mL的DMEM培养基。无血清培养基2：含青霉素、链霉素100 μg/mL，胰蛋白酶 2 μg/mL 的 DMEM 培养基。

2 方法

2.1 药物对细胞毒性实验 在96孔板上，每孔加入 0.1 mL，2×10-5的 MDCK 细胞，24 h待细胞长成单层后，加入用无血清培养基2稀释的不同浓度的含药无血清培养基继续培养。每一药物浓度均重复4孔，同时设置正常细胞对照组和溶剂对照组（DMSO-无血清培养基2=1∶10混合后过滤除菌）。每日于倒置显微镜下观察细胞变化，72h后，用MTT对活细胞进行染色[6]，读取A570，按公式计算细胞存活率。

细胞存活率=A570实验/A570正常×100%

2.2 药物抗病毒作用 空心莲子草有效部位提取物和利巴韦林注射液对甲型H3N2流感病毒的作用各分为3组。Ⅰ组（药物阻断病毒吸附、穿入组）：先将不同浓度药物加入到MDCK细胞上作用6 h后，弃去药液,加入经15 μg/mL胰酶预处理后的100 TCID50病毒液作用2 h，再更换成无血清培养基2。Ⅱ组（药物直接杀伤病毒组）：100 TCID50病毒液与不同浓度药物4℃作用6 h后，再用15 μg/mL胰酶预处理,再加入到MDCK细胞上吸附2 h,最后更换为无血清培养基2。Ⅲ组（药物抗病毒生物合成组）：先将100 TCID50病毒液用15 μg/mL胰酶预处理后,加入到MDCK细胞上吸附2 h，再更换为不同浓度含药维持液。

Ⅰ～Ⅲ组每个浓度重复4孔，同时设病毒对照组、正常细胞对照组和溶剂对照组。37℃、5%CO2培养，每日于倒置显微镜下观察细胞变化。待病毒对照组细胞病变效应（CPE）[7]达80%以上，且细胞对照组正常时，用MTT对活细胞染色，读取A570吸光值，按下列公式计算药物对病毒的抑制率[8]：

病毒抑制率（%）＝（药物处理组A值-病毒对照组A值）/（正常细胞对照组A值-病毒对照组A值）×100%

2.3 数据处理 各项实验均重复3次以上，然后分别计算各数据平均值及标准差，用统计软件SPSS 18.0以Probit回归计算药物半数毒性浓度（TC50）与半数有效浓度（IC50）。以TI作为药物抗H3N2作用的评价指标，TI=TC50/IC50[9]。

3 结果

3.1 药物对MDCK细胞的毒性作用 空心莲子草有效部位提取物和利巴韦林注射液对MDCK细胞的毒性作用表现为：细胞折光性增加、细胞变圆、破碎、脱壁，且药物对细胞的毒性作用在一定范围内随着药物浓度的增加，细胞存活率降低。计算空心莲子草有效部位提取物和利巴韦林注射液TC50分别为（115.39±1.26）μg/mL，（454.012±10.03）μg/mL。溶剂对照组显示DMSO小于1%时细胞存活率未受影响，用于药效学的药物混合液中DMSO最高的仅有0.2%。

3.2 药物对甲型H3N2流感病毒的抗病毒作用

实验结果表明，空心莲子草有效部位提取物和利巴韦林注射液的抗病毒生物合成组均能明显减轻甲型H3N2流感病毒感染MDCK细胞的细胞病变效应（CPE）程度，且呈明显量-效关系。利巴韦林尚具有一定程度阻断病毒吸附穿入和直接杀伤病毒的作用。实验结果见表1、表2。

表1 空心莲子草有效部位提取物抗病毒生物合成组（n=3，±s）Tab.1 The antiviral biosynthesis group of Alternanthera Philoxeroides effective fractions extracts（n=3，±s）

表1 空心莲子草有效部位提取物抗病毒生物合成组（n=3，±s）Tab.1 The antiviral biosynthesis group of Alternanthera Philoxeroides effective fractions extracts（n=3，±s）

给药方式 药物浓度（μg/mL）病毒抑制率（%）IC50（μg/mL）TIⅢ125.0081.08±1.4662.5068.98±1.4631.2551.09±0.7315.6337.47±1.1747.52±0.432.43±0.017.8118.98±1.103.919.97±0.92

表2 利巴韦林抗甲型H3N2流感病毒作用（n=3，±s）Tab.2 Antiviral activity of Ribavirin injection against virus A H3N2（n=3，±s）

表2 利巴韦林抗甲型H3N2流感病毒作用（n=3，±s）Tab.2 Antiviral activity of Ribavirin injection against virus A H3N2（n=3，±s）

给药方式 药物浓度（μg/mL）病毒抑制率（%）IC50（μg/mL）TIⅠ 1000.0086.98±0.76500.0067.88±0.73250.0046.11±0.92125.0023.11±1.72404.10±3.481.12±0.0262.5012.41±1.1031.257.66±1.10Ⅱ 1000.0083.46±1.28500.0064.60±1.10250.0044.04±0.76125.0026.03±0.76433.37±9.801.05±0.0162.5013.26±0.4231.257.78±0.92Ⅲ 125.0085.16±0.7662.5069.46±0.7631.2553.16±0.9215.6336.38±0.7644.74±1.2210.15±0.097.8119.71±1.313.907.91±0.56

4 讨论

本实验以空心莲子草有效部位提取物为研究对象，通过MTT法测定了其对MDCK细胞的毒性，建立Probit回归模型,计算其半数毒性浓度TC50为（115.39±1.26）μg/mL。抗病毒实验结果表明，空心莲子草有效部位提取物对流感病毒有明显抗病毒生物合成作用，其 TI为（2.43±0.01），但其阻止流感病毒吸附与直接杀伤流感病毒的作用不明显。因此，本研究结果阐释了空心莲子草有效部位提取物抗病毒的生物活性，为其开发应用提供了参考依据。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：人民卫生出版社，1977：376-377.

[2]江苏新医学院.中药大辞典（上册）[S].上海：上海科学技术出版社，1977：1470-1471.

[3]李琼娅，范文乾，马 卓，等.空心莲子草化学成分和药理活性研究进展[J].时珍国医国药，2007，18(2):334－335.

[4]马 卓，李琼娅，范文乾，等.莲子草属药用植物的研究进展[J].化学与生物工程，2008，25（2）：1－6.

[5]孟庆楠，张浩楠，王益民.MTT法检测银杏叶注射液对人脑微血管内皮细胞增殖的影响[J].天津中医药大学学报，2001，30（1）：36-37.

[6]Marina P,Sonia S,Umberto B,et al.Interference in MTT cell viability assay in activated macrophage cell line[J].Anal Biochem,2003,13(2):38-39.

[7]张艳丽，顾立刚，王庆国，等.清肺注射液不同配伍体对流感病毒增殖的影响[J].天津中医药，2007，24（5）：411-413.

[8]贺凤兰，刘 强，刘媛媛，等.欧意清热解毒软胶囊体外抗甲型H1N1 流感病毒作用[J].中国中药杂志，2011，36（14）：1993－1996.

[9]刘 强，贺凤兰，刘媛媛，等.盐酸阿比朵尔胶囊抗甲型H1N1流感病毒的体外实验研究[J].中国药学杂志，2011，46（2）：108－112.