银杏内酯A、B对高胆固醇诱导的PC12细胞胆固醇代谢的影响*

张云莎，马东明，卢 斌，马轶文，姜希娟

（1.天津中医药大学病理教研室，天津 300193；2.天津中医药大学实验教学部，天津 300193；3.天津市塘沽区妇幼保健院，天津 300451）

近年来，银杏叶有效单体被广泛用于防治阿尔茨海默病（AD），取得了较好的疗效，但其作用机制尚未完全阐明。基于脑胆固醇代谢紊乱在AD发病中发挥着重要作用，或可假定银杏叶有效单体银杏内酯A、B能通过调节脑胆固醇代谢起到保护神经元的作用。

前期工作中，笔者建立体外血脑屏障（BBB）环境下PC12细胞的高胆固醇损伤模型，研究发现高胆固醇环境下，PC12细胞内总胆固醇含量增加，而银杏内酯A（GKA）和银杏内酯B（GKB）可以有效降低上述模型的细胞总胆固醇含量，其中以30 μmol/L GKA和25 μmol/L的GKB效果最佳[1]。基于此结果，本实验进一步来探讨GKA及GKB对PC12细胞内胆固醇代谢关键酶的影响，阐释GKA、GKB防治AD的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞 PC12细胞株（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤），购于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。

1.2 药品及试剂 DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone），马血清（Gibco），多聚－L－赖氨酸（Sigma），可溶性胆固醇（Sigma Cat NO.P6282），辛伐他汀（Sigma），银杏内酯 A（Ginkgolide A，NO.110862）和银杏内酯 B（Ginkgolide B，NO.110863）标准品购自宝鸡贝斯特植物原料有限公司，反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）二步法试剂盒（ABI），TRIZOL Reagent（Invitrogen），Tris、DEPC（Sigma）。其余试剂均为市售分析纯。

1.3 仪器 CO2培养箱（SANYO），超净化工作台（日立），IX－70型倒置显微镜（Olympus），Universal 16R低温高速离心机（Beckman）；ABIPrism7000PCR仪（ABI）。

1.4 体外血脑屏障环境下PC12细胞胆固醇损伤模型建立 参照文献[2]利用Transwell装置培养脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞，建立BBB体外模型。将BBB置于培养有PC12细胞的6孔板内，然后在Transwell内皮细胞侧加入含40 μmol/L终浓度可溶性胆固醇的培养基继续作用24 h，作为高胆固醇损伤模型[3]。

1.5 实验分组及干预 对照组（C），普通培养基培养；模型组（M），40 μmol/L 胆固醇处理 24 h,更换正常培养基继续培养16 h；GKA组，40 μmol/L胆固醇处理24 h,更换含30 μmol/L GKA的培养基继续培养16 h；GKB组，40 μmol/L胆固醇处理24 h，更换含25 μmol/L GKB的培养基继续培养16 h。

1.6 RT-PCR测定胆固醇代谢相关酶的基因表达采用Trizol试剂盒提取细胞总核糖核酸（RNA）。依试剂盒说明书，采用TaqMan Reverse Transcription Reagents试剂盒和oligod（T）16 引物将总 RNA（0.2μg）反转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA）（10 μL体系）。0.5 μL的cDNA产物用作定量PCR扩增的模板。PCR扩增反应采用SYBR Green PCR Master Mix reagent kits试剂盒和特异性引物（见表1）。数据采用 2-ΔΔCT相对定量法分析。

表1 引物种类及引物序列Tab.1 Primer type and primer sequences

1.7 统计学处理 采用SPSS16.0软件分析，计量资料均以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较时若方差齐则选用LSD检验，若方差不齐则选用Tam hane’s T2法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

高胆固醇环境下，调节细胞胆固醇摄入的关键物质低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP-1）表达降低（P＜0.01）；细胞内胆固醇酯化关键酶乙酰胆固醇酰基转移酶（ACAT）及胆固醇流出关键通道蛋白ATP结合盒转运子 A1（ABCA1）表达上调（P＜0.05）；胆固醇羟化酶24S-羟化酶（CYP46）的表达无变化。药物干预后，上调了LRP-1的表达（P＜0.05），但对其他酶的表达无明显影响。见表2。

3 讨论

近年来的研究表明，外周高胆固醇血症可以影响BBB的通透性引起脑胆固醇水平升高，而且胆固醇代谢通路中的关键物质可以直接参与到AD的发生发展过程中。

脑内胆固醇主要由星形胶质细胞合成，由载脂蛋白E经LRP转运给神经元。一部分游离胆固醇被神经元内质网中的ACAT酯化，ACAT是调节细胞内胆固醇代谢和分布的关键成分。另外一部分胆固醇经胆固醇流出调节蛋白（CERP）排出细胞外，构成胆固醇逆向转运的第一步，其中ABCA1起主要作用；最后脑胆固醇在CYP46的作用下转化为24S-羟胆固醇，后者能够通过BBB，由低密度脂蛋白（LDL）转运至肝脏代谢。

表2 高胆固醇环境下PC12细胞胆固醇代谢关键酶的表达及GKA、GKB的影响（n=8）Tab.2 The effects of GKA and GKB on cholesterol metabolism key enzymes in PC12 cells exposed to high cholesterol（n=8）

β淀粉样蛋白（Aβ）沉积是AD的主要病理学特征。正常脑组织内Aβ的含量取决于合成与清除的速率。Aβ由淀粉样前体蛋白（APP）加工合成，主要经由脑内皮细胞膜表面的LRP介导，经BBB流出到外周[4]。有研究发现脑组织中Aβ明显沉积的AD患者，LRP水平下调；上调LRP的表达后，Aβ的沉积减少[5]。Aβ沉积导致神经元的丢失，因此，持续有效的清除Aβ是避免其在脑内沉积的重要机制。靶向LRP的治疗已成为防治AD的重要策略之一。

目前研究表明神经元内胆固醇的分布形式影响着Aβ的产生。ACAT在细胞内胆固醇分布中起着关键作用，它可能通过调节胆固醇与胆固醇酯的动态平衡而影响Aβ的产生[6]。有研究认为细胞内胆固醇酯含量越高，Aβ的产生越多，反之亦然[7]。Hutter-Paier等[8]在APP转基因AD小鼠模型中给予ACAT抑制剂后，发现小鼠脑中Aβ沉积减少；进一步的研究表明ACAT可能通过影响APP裂解方式促进Aβ合成，ACAT的活性轻度降低就能产生强烈的抑制Aβ生成作用[9]。

ABCA1是一种膜相关蛋白，主要是利用ATP将胆固醇从细胞膜内层转移至外层，使其与载脂蛋白结合，从而介导胆固醇的外流。研究表明，ABCA1在载脂蛋白E结合胆固醇的过程中发挥重要作用。过表达ABCA1的小鼠，可增强脂蛋白的转运，减少Aβ的沉积[10]。而24S-羟胆固醇作为脑胆固醇代谢的最终产物，在脑脊液中的蓄积也发挥着神经毒性作用，引起神经退行性变[11]。24S-羟化酶的活性决定24S-羟胆固醇的浓度，近年来多项研究显示[12-13]，CYP46基因的多态性与Aβ沉积密切相关。

本研究发现，高胆固醇环境下，PC12细胞高表达了ACAT及ABCA1，低表达了LRP，提示外周高胆固醇血症可能会影响脑内胆固醇代谢相关酶的表达；给予药物干预后发现，除LRP水平上调外，其余无明显改变，提示GKA、GKB可能通过调控LRP的水平，促进Aβ的清除，达到防治AD的作用。

[1]郭茂娟,范英昌,卢 斌,等.银杏内酯B对高胆固醇诱导的PC12细胞胆固醇含量的影响[J].中国病理生理杂志，2012，28（1）：173－176.

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