疏肝健脾方对腹泻型肠易激综合征大鼠血浆及结肠组织5-HT、SP、VIP的影响*

2012-11-29汪正芳郭前坤张声生

天津中医药 2012年5期

汪正芳，郭前坤，张声生

（首都医科大学附属北京中医医院消化中心，北京 100010）

肠易激综合征（IBS）是肠道动力学和内脏感觉异常的胃肠道功能性疾病，是一组以排便习惯改变（腹泻、便秘）、粪便性状异常（稀便、黏液便）、腹胀及腹痛等为临床表现的综合征，症状可持续存在或间歇发作[1]。临床上以腹泻型为多见[2-3]。IBS病因及发病机制至今尚未完全阐明，目前治疗缺乏确切而有效的办法。中医学认为腹泻型肠易激综合征与肝郁、脾虚密切相关[4]。笔者采用具有调肝理脾、燥湿止泻作用的疏肝健脾方治疗腹泻型肠易激综合征（D-IBS）在临床已经取得了很好的疗效。本实验以血浆中的 5-羟色胺（5-HT）、P物质（SP）及血管活性肠肽（VIP）和结肠组织中SP及VIP为主要测定指标，以得舒特为阳性对照药，观察疏肝健脾方对D-IBS模型大鼠的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（200±20）g，北京维通利华实验动物公司提供，合格证号：SCXK（京）2006-0009。

1.2 药品与试剂冰醋酸，国药集团化学试剂有限公司（批号：20110517）。得舒特（匹维溴安），法国苏威制药（批号：621959）。5-HT、SP及VIP试剂盒由北京华英生物技术有限公司提供。

疏肝健脾方：由党参、白术、八月札、白芍、陈皮等药物组成，均由首都医科大学附属北京中医医院制剂中心制备，按一定比例制成生药浓度分别为1.7、3.4、6.8 g/mL 备用。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组大鼠适应性喂养3 d后按随机数字表法随机分组为正常组、模型组、得舒特组，以及中药低、中、高剂量组，每组10只。正常组：正常喂食，自由饮水，不予任何处理；模型组，得舒特组及中药低、中、高剂量组以乙酸灌肠加束缚应激的方法建立D-IBS大鼠模型。

1.3.2 造模方法实验前18 h禁食、不禁水，乙醚麻醉后经肛门插入连接注射器的硅胶管（距肛门8 cm），结肠内灌入40 mL/L的乙酸1 mL，缓慢拔出硅胶管，用手压迫肛门并将大鼠尾巴抬高30秒，后用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）1 mL冲洗结肠[5]，放回笼中自由活动进食水，于第7天行束缚应激，每天用宽透明胶带束缚前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓头面部[6]，束缚时间2 h，连续束缚7 d。

1.3.3 动物给药方法各组造模结束后第2天开始进行药物干预。得舒特组按照实验动物研究“等效剂量”的计算方法，给予15 mg/（kg·d）灌胃给药；中药低、中、高剂量组（按60 kg成人体表面积换算，低、中、高剂量组分别为标准剂量组、2倍剂量组及4倍剂量组）分别给予17、34、68 g/（kg·d）；正常组和模型组每天灌服等容量生理盐水，连续治疗14 d。给药体积10 mL/（kg·d）。

1.4 检测指标及方法观察大鼠的一般情况，检测大鼠粪便的含水量及腹壁撤退反射（AWR）评分，血浆及结肠组织中5-HT、SP及VIP含量。

1.4.1 粪便含水量在大鼠造模完成后及治疗结束后分别称量各组大鼠粪便的湿质量及干质量，粪便含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.4.2 AWR评分大鼠实验前18 h禁食不禁水，在乙醚麻醉下，将涂石蜡油带气囊的8F导尿管经肛门插入（气囊末端距肛门1 cm，在肛门外1 cm处将其固定在大鼠尾根部），将大鼠放入特制的透明塑料桶笼内（20 cm×8 cm×8 cm）中，只能前后运动不能转身，待大鼠适应环境30 min后开始实验。每只大鼠给予球囊扩张4次，容量分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mL，每次扩张持续5 min，间隔30秒（防止出现肠道缺血坏死）。

AWR评分标准[7]：0分，结直肠扩张刺激时大鼠情绪基本稳定；1分，给予刺激时开始出现不稳定，偶有扭动头部；2分，刺激时腹背部肌肉轻微收缩但腹部不抬离地面；3分，给予刺激时腹背部肌肉较强烈收缩并有腹部抬离地面情况；4分，刺激时腹部肌肉强烈收缩，腹部呈弓形，腹部﹑会阴部抬离地面。

1.4.3 血浆及结肠组织标本采集

1.4.3.1 血浆标本制备以10%水合氯醛（3 mL/kg腹腔注射），麻醉下，腹主静脉取血3 mL，注入含有10%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）30 μL 和抑肽酶1000 KIU试管中混匀，低温离心15 min，转速2000 r/min，分离血浆，分装置于-20℃冰箱保存待测。测定前将样本置于自来水浴中复融，再次低温离心（1500r/min，15min），取上清进行放射免疫实验。

1.4.3.2 结肠组织标本制备禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，剖开腹腔，取出结肠并剪下（距离肛门8 cm以内），沿着肠系膜纵向剪开，用冰生理盐水反复冲洗，滤纸拭干，-80℃冰箱冻存。测前取出组织称质量后于生理盐水（1 mL）中煮沸3 min，冷却后加入1mol/L冰醋酸0.5mL于匀浆器中匀浆，再用1 mol/L NaOH中和，低温离心20 min，3000 r/min。取上清液储存于-20℃以下待测。

1.5 统计方法用SPSS18.0统计软件分析，所有实验计量数据均以均数±标准差（±s），正态分布计量资料组间比较采用单因素方差分析，偏态分布计量资料组间比较采用轶和检验，以P<0.05为差异且有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠存活情况及一般情况观察在实验过程中，共死亡5只大鼠，其中中药高剂量组2只，中剂量组1只，得舒特组2只，其余各组大鼠情况良好。笔者在使用乙酸灌肠加束缚应激造模过程中发现大鼠性情明显改变，急躁易怒，触碰不得；毛发晦暗无光泽，食欲下降，排稀便明显，与D-IBS的临床表现相近。上诉表现经药物干预后各治疗组均较模型组有明显好转。

2.2 疏肝健脾方对大鼠粪便含水量的影响疏肝健脾方能明显改善D-IBS大鼠粪便的含水量，促进肠道对水分的重吸收增加，与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。高剂量疏肝健脾方要优于匹维溴铵（P＜0.05）。见表1。

表1 治疗前后粪便含水量的比较（±s）Tab.1 Comparison of defecation moisture before and after treatmen（±s）%

注：与模型组比较，*P<0.01，与得舒特组比较，#P<0.05。

组别给药后正常组 20.45±1.65*模型组 45.20±1.28得舒特组 25.41±2.08*疏肝健脾低剂量组 30.33±3.41*疏肝健脾中剂量组 25.26±2.22*疏肝健脾高剂量组 20.17±2.86*#n 101081098给药前20.35±2.50*45.89±2.3745.07±2.4445.50±2.4644.90±2.6244.93±2.41

2.3 AWR的影响在不同的扩张容量下，模型组大鼠AWR评分较其余各组明显增加，说明模型组大鼠内脏敏感性增加，中药低剂量组虽也有改善，但在不同扩张容量下不一致，说明疏肝健脾方剂量太少时也达不到很好的改善内脏敏感性的作用。见表2。

表2 给药后AWR比较（±s）Tab.2 Comparison of AWR after treatmen（±s）分

注：与模型组比较，*P<0.01，#P<0.05。

组别 1.0 mL 1.5 mL 2.0 mL正常组 0.90±0.42*1.97±0.19*2.67±0.31*模型组 1.50±0.362.63±0.253.73±0.26得舒特组 0.97±0.25*2.03±0.19*2.73±0.31*疏肝健脾低剂量组 1.30±0.292.43±0.16#3.60±0.21疏肝健脾中剂量组 1.03±0.29*2.10±0.16*2.77±0.32*疏肝健脾高剂量组 0.93±0.21*2.07±0.14*2.63±0.29*n 1010810980.5 mL 0.07±0.14*1.13±0.230.17±0.24*0.57±0.23*0.37±0.25*0.20±0.23*

2.4 疏肝健脾方对D-IBS大鼠血浆5-HT的影响疏肝健脾方中、高剂量组血浆5-HT含量明显低于D-IBS大鼠（P<0.05），疏肝健脾方低剂量组虽然与模型组也有区别，但是差异没有统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组血浆中5-HT含量的比较（±s）Tab.3 Comparison of 5-HT content in blood plasma of each group（±s）μg/L

注：与模型组比较，*P<0.01，#P<0.05。

组别 n 血浆5-HT含量正常组 10148.280±35.283#模型组 10195.545±25.383得舒特组 8151.594±39.852#疏肝健脾低剂量组 10188.850±17.628疏肝健脾中剂量组 9162.881±17.498#疏肝健脾高剂量组 8139.796±30.826*

2.5 疏肝健脾方对D-IBS大鼠血浆及结肠组织SP的影响疏肝健脾方各剂量组血浆中SP含量较D-IBS大鼠低，但差异无统计学意义（P>0.05）；疏肝健脾方可以改善D-IBS大鼠结肠组织中SP水平（P<0.05）。见表4。

表4 各组血浆及结肠组织中SP含量的比较（±s）Tab.4 Comparison of P content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

注：与模型组比较*P<0.01，#P<0.05。

组别 n 血浆SP含量结肠组织SP含量正常组 1060.767±8.8247.743±1.907模型组 1066.174±6.1058.918±1.356得舒特组 860.821±5.1748.149±1.028疏肝健脾低剂量组 1052.651±9.0717.538±1.070*疏肝健脾中剂量组 963.942±7.3207.155±0.713*疏肝健脾高剂量组 864.091±3.4227.424±1.378#

2.6 疏肝健脾方对D-IBS大鼠血浆及结肠组织VIP的影响疏肝健脾各剂量组血浆及结肠组织中VIP含量均较D-IBS模型组低，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。

3 讨论

D-IBS临床上主要以腹泻、腹痛或腹部不适为主症，其病因及发病机制复杂，其病理生理学变化主要包括胃肠道动力紊乱及内脏感觉敏感度异常等，目前认为与精神因素，胃肠激素变化，炎症介质及免疫因素等有关[8]。脑肠肽是调节胃肠道运动的重要物质，与IBS发病密切相关，常见有5-HT、VIP、SP、神经肽-Y（NPY）等[9]。中医学根据其临床表现，将 D-IBS 归属于“泄泻”、“腹痛”、“肠郁”等范畴，主要病机是肝郁脾虚、肝脾不和、脾虚湿盛。疏肝健脾方是多年临床实践和研究得出的治疗D-IBS的经验方，主要是由党参、白术、八月札、白芍、陈皮等药物组成。方中以党参、白术、白芍为君药奏调肝理脾之功；臣以八月札、陈皮等以健脾理气燥湿；诸药合用，调肝、理脾、燥湿、止泻，诸功兼备，标本兼治。笔者采用乙酸灌肠加束缚应激的方法制备D-IBS动物模型以腹泻为主要症状，伴有烦躁、抑郁等变化，与D-IBS临床症状相似，使用该模型来探讨疏肝健脾方治疗D-IBS的作用机制。

表5 各组血浆及结肠组织中VIP含量的比较（±s）Tab.5 Comparison of VIP content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

注：与模型组比较，*P<0.05。

组别 n 血浆VIP含量结肠组织VIP含量正常组 1025.738±3.403* 4.290±0.940*模型组 1029.871±3.7785.554±1.195得舒特组 827.063±4.6024.782±0.937疏肝健脾低剂量组 1028.049±5.0274.909±0.340疏肝健脾中剂量组 927.936±3.9804.616±0.658疏肝健脾高剂量组 827.298±5.4064.555±0.809

5-HT作为一种脑肠肽，近年来被认为是参与IBS发病的胃肠激素之一，是目前研究的热点问题。Wade[10]和Kyosola[11]研究表明IBS患者血浆5-HT含量升高；张川等[12]的研究也表明D-IBS患者血清中5-HT浓度增高；5-HT的异常升高是导致肠道动力异常和内脏感觉过敏，也是引起腹泻的重要物质[13]。本实验研究结果提示，本方能调节D-IBS大鼠血浆5-HT的异常变化，这可能是其改善D-IBS临床症状的作用机制之一。而低剂量组虽也有降低，但差异不显著，说明中药对IBS的治疗作用和剂量大小也有关系，呈现一定的量效关系，在剂量过小时治疗效果不甚明显。

SP是最早发现的一种神经肽，对SP与IBS的关系的研究，国内外尚无一致结论。张红杰等[14]的研究表明肠易激综合征的患者血浆中SP无显著的变化。李兆申等[15]的研究表明腹泻型肠易激综合征患者结肠黏膜SP含量显著高于正常对照组，并推测D-IBS肠黏膜SP含量升高可能与D-IBS患者结肠高动力，黏液分泌增多致腹泻有关。本实验研究结果也表明，血浆中SP的含量与肠易激综合征之间无显著性联系。而大鼠结肠组织中SP含量中药高、中剂量组明显低于模型组，与目前的研究结果一致，提示疏肝健脾方可能是通过改变SP的异常分泌以改善胃肠道的分泌和运动功能，达到治疗效果。

VIP是从猪小肠提取物中分离出的一种有明显扩张血管降低血压的物质，Morise K等[16]的研究发现，VIP与IBS患者的腹泻和腹痛等症状相关。李兆申等[15]的研究也表明D-IBS的患者血浆中血管活性肠肽的水平较正常人明显升高。笔者的实验结果提示，疏肝健脾方改善D-IBS的临床症状与抑制VIP的异常升高关系不是很密切。

综上所述，本实验以乙酸灌肠加束缚应激的方法建立的大鼠D-IBS模型在一定程度上模拟了人的D-IBS临床表现，在使用经验方疏肝健脾方干预后，发现疏肝健脾方可以有效缓解D-IBS大鼠腹泻及内脏高敏性，其作用可能是通过降低5-HT及SP而实现的，但是由于中药复方的成分不是十分肯定，起效物质也不是很明确，其具体的作用机制还有待进一步深入研究，但是调节胃肠激素很可能是疏肝健脾方发挥治疗作用的一个很重要的因素。

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