蔗糖密度梯度法定量口蹄疫完整病毒粒子(146S)的特异性研究

刘玉梅，刘 飞，孙艳琪，张立华，董俊余，赵丽霞，范秀丽，刘国英，卢永干

(1.金宇保灵生物药品有限公司，呼和浩特 010030;2.中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州 730046)

对于口蹄疫疫苗，其完整粒子(146S)是疫苗中最主要的抗原成分。146S在特定条件下分布在特定浓度的介质中，可于259 nm处产生最大紫外吸收峰(用OD259值表示)，并且OD259值与146S浓度成正比。蔗糖密度梯度法即将口蹄疫病毒样品置于蔗糖密度梯度上离心，在离心力的作用下，样品中所有的完整病毒粒子均沉降到相应的密度梯度层内。将已知的完整病毒粒子经蔗糖梯度离心后，在8至11级份层经紫外分光光度计259 nm检测时有最高吸收峰，而在其他级份层没有吸收峰。收集146S吸收峰级份，用紫外分光光度计进行检测，即可对146S含量进行定量。

146S定量检测早在20世纪80年代即被OIE推荐使用，目前仍是OIE及南美一些国家和地区国际口蹄疫抗原库每年定期监测检验各类口蹄疫抗原的主要手段。2008年，金宇保灵生物药品有限公司悬浮培养生产口蹄疫灭活疫苗获得成功，其中采用密度梯度离心法定量146S检测技术是成功的核心技术之一，解决了口蹄疫灭活病毒液无法准确定量的技术难题。本试验对密度梯度定量146S的特异性进行了研究。

1 材料

1.1 细胞培养基 BBSM细胞培养基3批，每批10000 mL。

1.2 细胞液 用BBSM细胞培养基培养细胞后收获细胞液(不含病毒成份)3批，每批100 mL。

1.3 FMDV纯化灭活抗原液 取口蹄疫病毒毒价LD50≤10－7.5/0.2 mL 的病 毒液 3 批，批号 为M021029、M022030、M024031，经常规纯化灭活后备用，每批100 mL。

1.4 146S抗原 共3批，批号分别为 YZ02010、YZ02011、YZ02012，每批 5 mL。

1.5 化学试剂 PEG－6000、蔗糖、PBS液等。

1.6 仪器设备 日立超速冷冻离心机、贝克曼高

速冷冻离心机、瓦里安紫外分光光度计。

2 方法

2.1 蔗糖密度梯度定量146S检测方法 首先3000 r/min离心处理病毒液10 min除去杂蛋白;按3% ～10%(W/V)量分别加入PEG，搅拌4 h后过夜，以10000 r/min离心60 min，弃去上清，用0.04 mol/L PBS液重悬至原体积的1/8～1/12，得到病毒浓缩液，置于2～8℃冰箱中备用。制备15% ～45%均匀线性蔗糖梯度，对所述病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心，利用用紫外分光光度计检测OD259值，根据公式，计算 146S 的含量［1－2］。

2.2 纯化146S灭活抗原酸解试验

2.2.1 146S裂解方法 每批提纯146S抗原等量吸取4 份，用 pH 值7.6、pH 值 6.0、pH 值 5.0、pH 值4.0 的0.04 mol/L PBS 缓冲液25 ℃处理2 h，同时设立PBS空白对照，应用蔗糖密度梯度离心，紫外分光光度计检测OD259值，把吸收峰消失与PBS空白对照基本一致样品pH值确定为146S裂解条件［3－4］。

2.2.2 抗原裂解前后146S含量检测 取待检样品30 mL，按照蔗糖密度梯度检测方法，将其离心处理后，取上清20 mL分成2份浓缩沉淀病毒液，弃去上清，一份沉淀用0.04 mol/L pH值7.6的PBS重悬为1 mL，另一份沉淀用146S裂解条件下的PBS溶液重悬为1 mL，同时设立PBS空白对照，应用蔗糖密度梯度离心，紫外分光光度计检测OD259值，计算146S的含量。

2.3 细胞液干扰试验 为进一步验证蔗糖密度梯度离心法定量146S的特异性，对不含病毒的细胞液按照蔗糖密度梯度离心法进行检测，验证能否在8至11级份检测到峰值。取纯化灭活处理后细胞液15 mL，按照蔗糖密度梯度检测方法，将其离心处理后，浓缩沉淀，弃去上清，沉淀用0.04 mol/L pH值7.6的PBS重悬，同时设立PBS空白对照，经蔗糖密度梯度离心后，用紫外分光光度计检测OD259值。

3 结果

3.1 146S裂解试验结果 3批提纯146S抗原经四种不同pH值PBS酸解处理后的146S含量检测结果见表1，蔗糖密度梯度离心后紫外检测8～11级份OD259值曲线图见图1－图3。

表1 提纯146S抗原酸解后的146S含量测定

图1 YZ02010纯化146S抗原OD值检测分布图

图2 YZ02011纯化146S抗原OD值检测分布图

图3 YZ02012纯化146S抗原OD值检测分布图

可以看出，3批抗原均在pH值7.6时可检测到FMD完整病毒粒子，而在pH值6.0以下时FMD病毒完整粒子破解，不能检测到相应的OD259值，与PBS空白对照一致。

3.2 蔗糖密度梯度法检测灭活病毒液裂解前后146S含量结果 M021029、M022030、M024031三批灭活抗原液裂解前146S含量分别达1.77、6.60、3.67 μg/mL，裂解后 146S 峰值消失，检测不到146S含量，与PBS空白对照一致。

3.3 细胞液及对照相同批次病毒抗原液146S含量检测 结果见表2。

表2 细胞液及相同批次细胞接种病毒后病毒抗原液146S含量

可以看出，细胞液对146S没有干扰，检测到的8至11级份峰值应该是由真实口蹄疫病毒粒子146S组成。

4 分析与讨论

4.1 提纯的146S抗原，经蔗糖密度梯度离心法检测，在8至11级份OD259有最大吸收峰，符合146S特性。选择 pH6.0、pH5.0、pH4.0 PBS 酸解处理提纯的146S后，8至11级份OD259峰值均消失，146S由酸解前的 1.77、6.60、3.67 μg/mL 至酸解后完全不能检测到，说明经酸解后146S已裂解，同时也初步证明蔗糖密度梯度离心法检测的抗原8至11级份峰值是由146S组成的。考虑到酸性过强会引起蛋白质变性和凝聚，建议采用pH值6.0缓冲液进行酸解。

4.2 按照蔗糖密度梯度离心法，对不含病毒的细胞液进行检测，结果3批细胞液在8至11级份均没有明显吸收峰，而且其 OD259值与PBS空白对照OD259值基本平行一致，说明利用蔗糖密度梯度离心法检测口蹄疫病毒抗原，不含病毒的细胞液对检测结果没有明显干扰，即检测到的抗原样品8至11级份峰值均是由146S组成，进一步验证蔗糖密度梯度法测得146S具有很好特异性。

4.3 该检测方法不但特异性好，而且快速、准确、直观、稳定、设备简单易于操作，1～3日内就可完成检验，可精准计量口蹄疫病毒粒子数量，经多次重复试验偏差不高于0.2 μg/mL，易于推广使用。尤其通过对成品疫苗146抗原含量的测定，可精确反映疫苗有效抗原水平，有望替代PD50动物攻毒方法，降低生物安全隐患，意义重大。该方法可用于口蹄疫企业生产检验，也可应用于各级兽医监督、管理部门对疫苗的评估和评价工作。

［1］ Fayet M T，Fargeaud D，Louisot P，et al.Physical chemical measurement of 140S particles of the foot and mouth disease virus［J］.Ann Inst Pasteur(Paris)，1971，121(1):107 －118.

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［3］ 谢庆阁.口蹄疫［M］.北京:中国农业出版社，2004.

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