HPLC测定大鼠肝微粒体温孵体系中二氢血根碱的含量

伍 勇，刘兆颖，姚芳芳，朱若岑，孙志良

(1.湖南农业大学动物医学院，长沙 410128;2.湖南农业大学东方科技学院，长沙 410128)

血根碱是一种苯菲啶异喹啉类生物碱，主要存在于罂粟科、蓝堇科及芸香科的植物中，具有抗菌、抗炎、抗高血压、抗肿瘤、增强免疫力、杀虫及促进动物生长等作用［1］。国内外研究者已经对血根碱的提取分离、药理作用、毒理作用等方面开展了较深入的探索，但对血根碱的药物代谢研究甚少，仅有一些以大鼠作为试验动物的初步研究，从报道中仅获知将大鼠灌胃血根碱后，二氢血根碱的生成是血根碱在体内代谢的主要途径［2］。同时，在血根碱转变成二氢血根碱这个过程中，参与的代谢酶研究未见任何报道。因此，建立血根碱的代谢产物二氢血根碱的液相色谱测定法，为研究参与血根碱代谢的酶奠定基础，亦为今后的临床合理使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 岛津2010AHT高效液相色谱仪(SIL－20A自动进样器、SPD－20A紫外－可见检测器、LCSolution工作站)(岛津企业管理(中国)有限公司);Hermle Z383K低温高速离心机(德国HERMLE(中国)有限公司);Sartorius TE 212－L电子天平，感量0.0001 g(北京赛多利斯公司)。

1.1.2 试药 血根碱(湖南美可达股份有限公司，批号20110626，纯度＞98%);二氢血根碱(湖南美可达股份有限公司，批号20110428，纯度＞98%);还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Roche公司，批号110322);水为超纯水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.1.3 动物 成年健康雄性清洁级SD大鼠，体重180～220 g，长沙市东创实验动物科技服务部提供(实验动物许可证号SCXK(湘)2009—0012)。

1.2 方法

1.2.1 钙沉淀法制备肝微粒体 大鼠断头处死，用冰冷生理盐水通过肝门静脉灌洗肝脏后，纱布吸干水分称重，再将肝组织剪碎片至1 cm3左右，然后加入4倍肝组织重量的0.25 mol/L的冰蔗糖溶液制成20%(W/V)的匀浆液。所得匀浆液在6000 r/min，4℃离心20 min，所得上清液按1 mL加入88 mmol/L的CaCl2溶液0.1 mL的比例进行混合，冰浴放置5 min后于14000 r/min，4℃离心15 min，沉淀为肝微粒体，适量0.05 mol/L Tris－HCl液(pH 7.4)重悬，－80℃保存备用，并采用Bradford法测定肝微粒体蛋白浓度［3］。

1.2.2 定量方法

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱 SHIMADZU VPODS(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为水 － 乙腈 (37∶63，V/V);流速1 mL/min;检测波长285 nm;柱温35 ℃;进样量 10 μL。

1.2.2.2 对照品溶液制备及标准曲线溶液配制精密称取二氢血根碱对照品0.0068 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀配成2 mmol/L二氢血根碱甲醇储备溶液。然后加入空白肝微粒体，用0.05 mol/L Tris－HCl缓冲液 (pH 7.4)稀释成1000、500、100、50、25 nmol/L 二氢血根碱溶液。

1.2.2.3 方法专属性 分别设置空白肝微粒体组、空白肝微粒体加二氢血根碱组和生成二氢血根碱的温孵反应体系组，按1.2.2.1项下色谱条件进行测定。

1.2.2.4 最低检测限 取二氢血根碱标准贮备液适量，用Tris－HCl缓冲溶液稀释成浓度较低的一组样品，每个浓度测定5次，记录每次测得的信号强度S与背景信号强度N，以能达到S/N=3时样品的最低浓度为最低检测限。

1.2.2.5 线性关系 将标准曲线溶液按 1.2.2.1项下色谱条件进行测定，以峰面积(A)为横坐标，药物浓度(C)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.6 精密度试验 在肝微粒体温孵液中加入二氢血根碱标准液，使二氢血根碱的浓度分别为50、100、500 nmol/L，按1.2.2.1 项下色谱条件测定二氢血根碱的日内、日间RSD。

1.2.2.7 回收率试验 配制二氢血根碱浓度分别为50、1000 nmol/L的肝微粒体样品各5份，照1.2.2.1项下色谱条件进行测定。

1.2.2.8 稳定性试验 分别取 50、100、500 nmol/L二氢血根碱标准液，分别置室温、－20℃反复冻溶3次，再测试其含量，考察其的稳定性。

1.2.3 肝微粒体温孵反应体系与样品处理 肝微粒体温孵反应体系总体积为300 μL，组成依次为:60 μL 蛋白浓度为10 mg/mL 的肝微粒体，30 μL 浓度为100 μmol/L 血根碱溶液，30 μL 浓度为 20 mmol/L NADPH 溶液，用 0.05 mol/L Tris－ HCl缓冲液(pH为7.4)加到所需体积。此反应体系反应后用等体积冰冷乙腈终止反应，12000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm 的有机膜，滤液按色谱条件项下操作进行分析。

2 结果

2.1 方法专属性 从空白肝微粒体组、空白肝微粒体加二氢血根碱组和生成二氢血根碱的温孵反应体系组的色谱图(图1－图3)可以看出，二氢血根碱峰形较好，与其他峰分离良好，且在肝微粒体中无内源性物质的干扰，说明本方法的专属性较好。

2.2 最低检测限 当 S/N≥3时，检测限为10 nmol/L。

2.3 线性关系 在25～1000 nmol/L范围内，二氢血根碱(DHSA)的响应与浓度成良好的线性关系。线性方程为 Y=33.5X+555.09，相关系数 r=0.9996。

2.4 精密度 50、100、500 nmol/L 3种浓度的标准溶液其日内 RSD 分别为2.26%、2.57%、3.02%，日间 RSD 分别为 6.21%、4.33%、3.95%，满足方法学的要求。

2.5 回收率 50、1000 nmol/L的二氢血根碱肝微粒体样品回收率结果见表1，结果满足方法学的要求。

表1 回收率测定结果(±s，n=5)

表1 回收率测定结果(±s，n=5)

加入量/(nmol·L －1)实测浓度/(nmol·L －1) 回收率/%50 50.86 ±1.30 101.72 ±2.60 1000 9882.02 ±26.28 98.82 ±2.63

2.6 稳定性 50、100、500 nmol/L二氢血根碱标准液在不同条件的稳定性考察结果见表2，表明二氢血根碱标准液在室温与－20℃较稳定。

表2 稳定性试验结果(±s，n=5)

表2 稳定性试验结果(±s，n=5)

加入量/nmol·L －1)室温实测浓度/(nmol·L －1)RSD/%－20℃实测浓度/(nmol·L －1)RSD/%50 49.05 ±1.17 2.39 50.13 ±3.19 6.37 100 98.42 ±2.61 2.65 97.86 ±5.11 5.22(500 493.38 ±14.21 2.88 487.90 ±15.52 3.18

3 讨论

样品处理方法优化过程中，结合相关提取方法［4－6］，分别尝试使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯进行提取，对比发现甲醇沉淀蛋白不完全，乙酸乙酯提取率低，而乙腈的提取效率高，且峰形好。

本实验建立的肝微粒体孵育体系中二氢血根碱的HPLC测定方法，在所用色谱条件下基线稳定，二氢血根碱保留时间适中，与肝微粒体孵育体系中其他成分完全分离，且峰形好，具有快速简便、灵敏度高、重现性好等优点，可适用于血根碱在大鼠肝微粒体中代谢产物二氢血根碱的定量以及酶促反应动力学研究。

［1］ 张启东，黄路枝，胡兆农，等.30种药用植物提取物杀虫杀菌活性研究［J］.西北植物学报，2006，26(6):1223 －1230.

［2］ Jitka Psotová，Borivoj Klejdus，Rostislav Vecera，et al.A liquid chromatographic－mass spectrometric evidence of dihydrosanguinarine as a first metabolite of sanguinarine transformation in rat［J］.Journal of Chromatography B，2006，830(1):165 －172.

［3］ 徐叔云.药理学实验方法［M］.北京:人民卫生出版社，2002:511－512.

［4］ 罗忠勇，曾建国，黄 敬，等.RP－HPLC法测定小果博落回中7种异喹啉类生物碱［J］.医学教育探索，2010，41(7):1188－1190.

［5］ 张剑勇，罗 杨，金晓峰.高效液相色谱法测定甘草颗粒中甘草酸的含量［J］.中国兽药杂志，2011，45(7):32 －34.

［6］ 任 杰，姚敬明，吴果桃，等.HPLC测定石榴皮提取物颗粒剂中不同时期鞣花酸含量的变化［J］.中国兽药杂志，2012，46(2):30－32.