水产品中氨基糖苷类药物残留的高效液相色谱－串联质谱检测方法研究

高 玲，张 丹，高 峰，郭 栋，杨瑞章，于伯华

(1.盐城出入境检验检疫局检测中心，江苏盐城 224002;2.江苏出入境检验检疫局，南京 200001)

我国在水产品出口中曾多次发生因抗生素以及激素等药物残留超标而导致的经济损失［1－2］。氨基糖苷类(Aminoglycosides，AGs)抗生素是一类分子结构中含有一个氨基环己醇和一个或多个氨基糖分子、以糖苷键相连物质的总称，用作兽药的主要有链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、新霉素和卡那霉素等几种［3－4］。此类抗生素的抗菌作用强，主要作用于革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌、产气杆菌等，属水产品中常用的抗生素。耳毒性和肾脏毒性是AGs共有的毒副作用。AGs能选择性地损害第8对脑神经，导致前庭和耳蜗神经损伤，前者多见于链霉素、卡那霉素和庆大霉素，后者多见于卡那霉素等。由于其毒副作用并易产生耐药性，链霉素族已被停用［5］。

韩国和日本对我国出口水产品中的氨基糖苷类药物残留要求控制在200 μg/kg以内。近年来，我国也加强了对动物源食品中该类药物的残留监控。但由于这类药物具有较高的水溶性和质子化倾向，易与组织成分结合或被玻璃器皿吸附，样品处理的回收率低;异构体较多，色谱分离过程复杂，分离条件不易控制等因素，目前对于氨基糖苷类抗生素残留的测定方法研究较少。对氨基糖苷类药物的检测很多采用液相色谱－荧光或紫外检测［6－8］，由于该类化合物结构中缺少发色团和荧光团，需进行柱前衍生化，操作较为繁琐，稳定性不高。氨基糖苷类抗生素水溶性好、极性大、分子量高，特别适合于液相色谱分析，因此，近年来液相色谱－串联质谱(HPLC－MS)技术成为测定该类化合物的有力手段［9－10］，但针对水产品基质的研究较少。

本文主要研究了采用HPLC－MS测定鱼、淡水小龙虾等水产品中氨基糖苷类抗生素残留的检测方法。方法快速、简便、灵敏度高，可以满足目前进出口及国家残留监控的要求。

1 实验材料

1.1 仪器 三重四级杆液质联用仪:Finnigan TSQ Quantum Ultra(配备HESI源);Surveyor液相色谱系统:液相系统包括自动进样器(Autosampler 1.4)，质谱泵(MS Pump 2.0)。涡旋混匀器(KW－80A上海医科大学仪器厂);分析天平感量为0.01 mg。

1.2 试剂 甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck)，甲酸(色谱纯，Fluka)，1－庚烷磺酸钠(色谱纯，东京化成工业株式会社)，七氟正丁酸(色谱纯)，水为重蒸蒸馏水。

1.3 药品 链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素购自Sigma－Aldrich公司，纯度≥98%。

1.4 溶液 标准储备液:准确称取一定量的标准品，用甲醇－水(30∶70)溶解定容，配制成1 mg/mL标准储备液，放置于0～4℃冰箱中保存(保存期12个月)。标准工作溶液:准确吸取一定量的1 mg/mL标准储备溶液，用0.5%七氟正丁酸－0.001 mol/L庚磺酸钠溶液(1∶1)稀释到相应标准工作溶液浓度，溶液浓度为 10、20、50、100、200、500 ng/mL，放置于冰箱中冷冻保存(保存期1个月)。提取液:取5.05 g庚烷磺酸钠、2.05 g磷酸钠、2.5 mL 磷酸，用500 mL超纯水溶解。

1.5 样品 水产品样品为各地送检样。

2 实验方法

2.1 HPLC条件 Hypersil Gold C18色谱柱 (100 mm ×2.1 mm，5 μm);流动相:A 相为乙腈，B 相为0.3%乙酸水溶液，流速0.25 mL/min，梯度洗脱程序见表1，柱温为室温;进样体积20 μL;分析时间为10 min。

表1 氨基糖苷类药物色谱分离的线性梯度洗脱程序

2.2 质谱条件 离子化方式:ESI，正离子检测;监测方式:MRM;鞘气:40，辅助气:5;电离电压:4000 V;离子化温度:350℃。主要质谱参数见表2。

表2 主要质谱参数

2.3 外标法定量 定量依据为外标法定量，定量离子采用丰度最大的二级碎片。

式中:X－试样中药物含量，μg/Kg;A－样品峰面积;V－定容体积，mL;As－标准品峰面积;m－样品质量，g;C－标准品浓度，μg/mL。

2.4 样品提取 称取5.00 g样品，准确加入15 mL提取液和3 mL 5%三氯乙酸－EDTA溶液，混匀1 min，超声15 min，于8500 r/min下高速离心5 min，取上清液用氨水调pH至3～4;滤液过HLB小柱(柱子用3 mL甲醇、5 mL超纯水预洗)，流速控制在1 d/s左右，用3 mL超纯水淋洗;用5 mL甲醇洗脱，收集于10 mL刻度离心管中，洗脱液于45℃氮气吹干，用0.5%七氟正丁酸－0.001 mol/L庚磺酸钠(1∶1)溶液溶解残渣，过水系0.45 μm的膜，待进样检测。

3 结果与讨论

3.1 实验条件的选择 要想使氨基糖苷类抗生素从水产品组织中游离出来，需要较高或较低的pH条件，通过比较，我们选择使用磷酸盐缓冲溶液，5种氨基糖苷药物均能获得较好的回收率。氨基糖苷类抗生素的检测需加入离子对试剂，同时，要求加入离子对试剂的浓度不能对质谱有显著影响，因此我们选择0.5%七氟正丁酸－0.001 mol/L庚磺酸钠溶液为定溶液。大多对氨基糖苷类药物检测的文献中会在流动相中也加入七氟正丁酸或三氯乙酸［11－12］，我们尝试用乙酸代替，发现同样可以获得较好的检测限，与加入七氟正丁酸或三氯乙酸没有明显差异，考虑乙酸对质谱的影响更小，因此在流动相中加入乙酸。比较了0.2%、0.3%和0.4%三个乙酸浓度，发现流动相中加入0.3%的乙酸时峰形最好，因此最终在流动相中加入0.3%的乙酸。

3.2 线性范围、标准曲线与检出限 以5种氨基糖苷类药物的色谱峰面积对质量浓度作线性回归，5种药物在10.0～500 ng/mL范围内线性良好(r＞0.99)，见表3。检出限(S/N ＞3)为5.0 μg/kg。通过阴性回鱼和淡水小龙虾加标测定，添加水平为10.0 μg/kg时，5种氨基糖苷类药物的信噪比S/N大于10，表明该方法所有的氨基糖苷类药物的定量下限均可达到 10.0 μg/kg。

表3 5种氨基糖苷类抗生素的线性回归方程及线性范围

3.3 方法的回收率和精密度 在阴性回鱼和淡水小龙虾的试样中添加 10.0、20.0、50.0 μg/kg 三个不同浓度水平的氨基糖苷类混合标准液，进行加标回收实验，每个浓度水平做6个平行性试验，结果见表4。阴性回鱼样品中添加5种氨基糖苷类抗生素药物的选择离子色谱图见图1。

表4 回鱼和淡水小龙虾中5种氨基糖苷类药物的回收率测定结果(n=6)

图1 阴性回鱼样品中添加5种氨基糖苷类药物的选择离子色谱图(加标水平50μg/kg)

从表4中的回收率和精密度数据可以看出，对于回鱼和淡水小龙虾两者基质，平均加标回收率均在63% ～102%，相对标准偏差在5.3% ～14.4%，能够满足检测方法的要求。

将此检测方法应用于出口鲫鱼、鲤鱼、回鱼、黄颡鱼、鳗鱼、淡水小龙虾、龙虾仁等20批样品，结果表明样品中均未检出链霉素等5种氨基糖苷类药物残留，表明盐城市出口水产品基地中大部分水产品用药情况较好，符合国家对水产品残留监控的要求。

4 结论

本文建立了水产品中链霉素等5种氨基糖苷类抗生素药物残留的液相色谱－串联质谱检测方法。磷酸缓冲溶液溶解样品，C18离子交换柱一步富集净化，有效去除基质干扰，方法快速简洁。经过优化质谱条件和前处理方法，获得了较低的方法检测限和较高的灵敏度，在实际检测工作中具有应用价值。

［1］ 曹 军，陈 勇，杨瑞章，等.分散固相萃取 －高效液相色谱/串联质谱法测定水产品中19种喹诺酮类兽药残留［J］.中国兽药杂志，2011，45(7):35 －37.

［2］ 高 玲，张 丹，高 峰，等.高效液相色谱 －串联质谱法检测蜂蜜和牛奶中的大环内酯类药物残留［J］.中国兽药杂志，2012，46(4):29 －33.

［3］ 张大弟，张晓红.氨基糖苷类药物污染与防治［M］.北京:化学工业出版社，2001:124－125.

［4］ 赵 壮，佟军威，张靖溥，等.氨基糖苷类药物耳毒性的斑马鱼模型的研究［J］.药学学报，2011，46(8):928 －935.

［5］ 徐维海.典型抗生素类药物在珠江三角洲水环境中的分布、行为与归宿［M］.广州:中国科学院广州地球化学研究所，2007:78－79.

［6］ Edder P，Cominoli A，Corvi C.Determination of streptomycin residues in food by solid－phase extraction and liquid chromatography with post－ column derivatization and fluorometric detection［J］.J Chromatogr A，1999，830(2):345 －351.

［7］ Kaale E，Leonard S，Van S A，et al.Capillary electrophoresis analysis of gentamicin sulphate with UV detection after pre－capillary derivatization with 1，2 －phthalic dicarboxaldehyde and mercaptoacetic acid［J］.J Chromatogr A，2000，895(1/2):67 －79.

［8］ 钱 疆，余孔捷，陈 健，等.液相荧光法检测乳制品中9种氨基糖苷类药物残留［J］.福建分析测试，2011，20(3):13 －17.

［9］ 孙 雷，张 骊，黄耀凌，等.超高效液相色谱－串联质谱法检测动物源食品中8种氨基糖苷类药物残留［J］.质谱学报，2009，30(1):60 －64.

［10］刘晓冬，林 洪，江 洁.动物源性食品中氨基糖苷类抗生素检测技术的研究进展［J］.安徽农业科学，2010，38(8):4128－4132.

［11］付启明，欧晓明，刘红玉.农产品中氨基糖苷类抗生素的残留检测方法研究进展［J］.农药，2009，48(11):784 －792.

［12］杨慧元，杜 玥，徐伟东.HPLC－MS/MS测定蜂蜜中氨基糖苷类药物残留［J］.中国现代应用药学，2011，28(8):751 －756.