单因素法考察蒙药清喉颗粒的提取工艺

杨万政 蒲维维 白音夫 王 捷

(1.中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;2.中国气象局北京城市气象研究所，北京100089;3.内蒙古自治区中蒙医研究所，内蒙古呼和浩特010020;4.内蒙古宇航人高技术产业有限责任公司，内蒙古呼和浩特011517)

清喉颗粒由金银花、牛蒡子、玄参、沙棘等7味药材组成的蒙药，具有清透热邪、利咽散结之功效。为提高中药保健品的质量，对其制备工艺条件进行了研究和考察。本文分别采用HPLC法河分光光度法，分别以溶媒、醇浓度、料液比、提取时间、提取次数和浸泡时间6个单因素来考察清喉颗粒的提取工艺。据文献报道，绿原酸的分析方法有薄层扫描法［1，2］、高效液相色谱法［3，4］、分光光度法［5，6］等;牛蒡子苷的测定方法有高效液相色谱法［7，8］和薄层扫描法［9］等。总黄酮的分析方法一般采取分光光度法［10，11］。

1 材料与仪器

1.1 药材:金银花、薄荷、牛蒡子、玄参、芦根购于北京同仁堂药店;沙棘购于水利部高原圣果有限公司;余甘子购于西藏药厂。

1.2 仪器:LC10－ADvp型高效液相色谱仪;V－550紫外可见分光光度计;Millipore纯水机;Adventurer电子分析天平。

1.3 标准品:绿原酸标、牛蒡子苷、芦丁购于中国药品生物制品检定所。(标准品批号)

1.4 试剂:甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 绿原酸的含量测定:色谱条件:色谱柱 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;检测波长327nm;流动相 乙腈－水(20:80)，磷酸调节 pH=4;流速 1mL·min－1;柱温30℃;分别准确移取浓度为8.5 mL的绿原酸对照品溶液0.5、1、2、4、6、8(mL)于 10mL 容量瓶中，用 50%甲醇稀释至刻度，各取20μL稀释液进样，在上述色谱条件下测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，直线回归得标准曲线方程为:y=54645x–122210，R2=0.9997。结果表明绿原酸进样浓度在8.5～68μg·mL－1范围内与峰面积线性关系良好。

取样品溶液1mL，用50%甲醇定容至10mL，过微孔滤膜，所得滤液为供试品溶液。在上述色谱条件下，取20?l进样测定峰面积。由标准曲线方程计算样品溶液中绿原酸的含量。

2.1.2 牛蒡子苷的含量测定:色谱条件:色谱柱 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相乙腈－水(30:70);流速1mL·min－1;检测波长 278nm;柱温30℃;

分别准确移取浓度为 8.7μg·mL－1对照品溶液 0.25、0.5、1、2、4、6、8(mL)于 10mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，各取20μL稀释液进样，在上述色谱条件下测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，直线回归得标准曲线方程为:y=11918x －2845.6，R2=0.9996。结果表明牛蒡子苷进样浓度在 2.175 ～69.600μg·mL－1范围内与峰面积线性关系良好。

取样品溶液1mL，用甲醇定容至10mL，过微孔滤膜，所得滤液为供试品溶液。在上述色谱条件下，取20μL进样测定峰面积。由标准曲线方程计算样品溶液中牛蒡子苷的含量。

2.1.3 总黄酮的含量测定:精确称取6.1mg芦丁标准品，用甲醇溶解，定容到250mL容量瓶中，备用。分别准确移取以上述对照品溶液 5、7、9、11、13、15(mL)于 25mL 容量瓶中，加5%AlCl3甲醇溶液1mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置 10min。

以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，直线回归得标准曲线方程为:y=0.0522x+0.0275，R2=0.9999。结果表明总黄酮浓度在4.880 ～14.640μg·mL－1范围内与吸光度线性关系良好。

取1mL样品溶液于25mL容量瓶中，加入1mL 5%AlCl3甲醇溶液，再加入甲醇定容，静置10min，进行测定，以标准曲线方程计算样品含量。

2.2 提取工艺单因素考察

有效成分得率=nCV/M×100% 其中:n为提取液稀释倍数;C为提取液中有效成分浓度，mg·mL－1;V为提取液体积，mL;M为药材的重量，g。

综合评分:因金银花为方中君药，绿原酸为金银花的主要有效成分，具有较高的药理活性，故绿原酸为重要指标之一，权重系数定为0.4。牛蒡子苷为牛蒡子的有效成分，且牛蒡子为方中臣药，因此，牛蒡子苷作为评价提取工艺的一个指标，权重系数定为0.3。作为大类成分间接控制的一个指标，总黄酮的权重系数定为0.3。

2.2.1 溶媒:取2份等量药材，分别加入10倍量水和10倍量70%乙醇，各提取1次，1h/次。将提取液过滤，浓缩并定容，得供试品液。按评价指标测定方法分别测定绿原酸、总黄酮、牛蒡子苷含量，计算有效成分得率。

表1 药材提取效率

由表1可见，醇提液比水提液的有效成分得率高，且水的极性大，易提取出果胶、黏液质、色素等多种杂质，使得提取液难于过滤、易于霉变、不易储藏，故选择乙醇为提取溶剂。

2.2.2 乙醇浓度:取5份等量药材，分别加入10倍量的50、60、70、80、90(%)乙醇，各浸泡2h，提取1 次，1h/次。将提取液过滤、浓缩后定容，得供试品液。按前述方法分别测定绿原酸、总黄酮和牛蒡子苷含量，计算有效成分得率。

从图1中可看出，70%的乙醇对绿原酸和牛蒡子苷都有较好的提取效果，而60%的乙醇则更适宜黄酮类化合物的提取。通过对3个有效成分的得率进行综合评价，选取70%乙醇作为提取溶剂。

2.2.3 料液比:取 5 份等量药材，分别加入 6、8、10、12、14倍的70%的乙醇，各浸泡2h，提取1次，1h/次。将提取液过滤、浓缩和定容，得供试品液，按前述方法分别测定绿原酸、总黄酮和牛蒡子苷含量，计算有效成分得率。

一般来说，溶媒用量越大，越利于有效成分的提取，随着料液比的增大，有效成分得率也在增加。从图2可看出，当料液比达到1:12后，绿原酸、牛蒡子苷得率随料液比的变化不大，说明溶剂已将有效成分基本溶出完全;当料液比为1:8时，最有利于总黄酮的提取。综合各料液比对有效成分得率的影响，从节约角度出发，选取料液比为1:10来进行实验。

图1 乙醇浓度对提取的影响

图2 药材与溶剂比对提取的影响

2.2.4 提取时间:取6份等量的药材，分别用10倍量70%乙醇浸泡 2h，提取 1 次，分别提取 0.5、1、1.5、2、2.5、3(h)。将提取液过滤、浓缩和定容，得供试品液，分别测定绿原酸、总黄酮和牛蒡子苷含量，计算有效成分得率。结果见图3。

提取时间过短不利于有效成分的浸出，但时间过长又会使大量杂质成分溶出，且有效成分的活性受到破坏，得不偿失，因此要控制好提取时间。由图3可以看出，随着提取时间的延长，有效成分得率提高。但时间增长到1.5h总黄酮和牛蒡子苷得率达到最大值，继续延长提取时间后，总黄酮和牛蒡子苷得率反而降低，说明提取时间过长会破坏有效成分，因此提取时间控制在1.5h左右即可。

图3 提取时间对提取率的影响

图4 浸泡时间对提取率的影响

2.2.5 提取次数:取3份等量药材，各用10倍量70%的乙醇浸泡2h，分别提取1次、2次、3次，1h/次。将提取液过滤、浓缩、定容，得供试品液，测定绿原酸、总黄酮和牛蒡子苷含量，计算有效成分得率。结果见表2。

表2 提取次数对提取效果的影响(n=3)

由表2可见，有效成分的得率随着提取次数的增加而增加。多次提取较一次提取可提高有效成分的浸出率，但不适当地增加提取次数会增加生产能耗，造成浪费，一般提取次数不超过3次为宜。

2.2.6 浸泡时间:取4份等量药材，分别用10倍量70%的乙醇浸泡 0、1、2、2、3(h)，各提取 1 次，1h/次。将提取液过滤、浓缩和定容，得供试品液，分别测定绿原酸、总黄酮和牛蒡子苷含量，计算有效成分得率。

中药饮片多数是干燥状态，在正式提取前予以适当的浸泡，能使饮片吸收溶媒，使组织浸润膨胀，有利于提取过程中溶质的加速溶解和扩散。提取时大多数情况下温度较高，如果中药材原料直接与热溶媒接触，会使表面的蛋白质层受热凝固，妨碍后续溶剂对细胞组织的渗透浸润，因此先用溶媒浸泡待提取原料后再进行提取，能够避免这一弊端。

从图4可看出，浸泡后有效成分的得率明显高于不浸泡而直接提取时有效成分的得率，浸泡时间达2h，绿原酸和牛蒡子苷浸出效果较好，综合3个有效成分得率大小，选择在提取前先浸泡2h。

3 结论

本文选取了溶媒、醇浓度、料液比、提取时间、提取次数和浸泡时间等6个单因素考察了清喉颗粒的提取工艺。实验结果表明:乙醇对有效成分的提取效果优于水的效果;70%的乙醇更适于有效成分的提取;从节约原料的角度出发，综合料液比对3种有效成分的影响大小，确定了料液比为1:10;由于长时间的煎煮会对造成有效成分的损失，选择提取时间为1.5h;浸泡2h再进行复方的提取效果更佳。

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