HPLC法测定三味益肝颗粒中丹参素钠的含量

章金凤 李佳林 张丽华

(1.内蒙古自治区乌兰察布市第二医院，内蒙古集宁 012000;2.内蒙古自治区人民医院，内蒙古呼和浩特 010017;3.内蒙古自治区天奇药业有限公司，内蒙古赤峰024000)

组方由酸枣仁、丹参、五味子3味草药组成，具有补心养肝，安神益智的作用。用于心肝血虚，神经衰弱引起的失眠健忘，头晕，头痛。为使本产品质量更加可控，经多次试验，确立了本品中丹参有效成分丹参素钠含量测定方法，阴性无干扰，经方法学考察，方法的重复性、稳定性、精密度、回收率试验均符合有关规定。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪:仪器型号 Lab Alliance;检测器:Model 500;泵:Series III;色谱工作站:ANASTAR;迪马Column Dimension柱(4.6×250mm ，5μm);AB135－S电子天平;Model C3860A超声波仪(上海超声仪器厂)。对照品:丹参素钠对照品(含量测定用 批号110855－200507)(中国药品生物制品鉴定所)。试剂:甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，水为二次蒸馏水。

2 方法和结果

2.1 波长的选择:取丹参素钠对照品适量，加甲醇溶液配成每1mL含0.102mg的溶液，在200～500nm的波长范围内扫描。结果本品在281nm处有最大吸收。

2.2 色谱条件:色谱柱:迪马Column Dimension柱(4.6×250mm，5μm)，流动相:甲醇 －乙腈 －磷酸三乙胺水溶液(取纯净水约800mL，置1000mL量瓶中，精密加入磷酸1.70mL振摇，精密加入三乙胺1.80mL，加纯净水稀释至刻度，摇匀，即得)(5:1:94)

2.3 溶液的制备

对照品溶液的制备:取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含206μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备:取本品适量，研细，取约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性干扰试验:取除丹参外其它药材按样品制备方法制成样品，按供试品溶液的制备方法制成丹参阴性样品溶液。

精密吸取供试品溶液、阴性液、对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪中，绘制液相色谱图，由色谱图提示，在对照品色谱相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性液在此峰位无吸收，对本品中丹参含量测定无干扰，方法专属性良好，见图(1～3)。

图1 丹参素钠对照品HPLC图谱

图2 三味益肝颗粒阴性样品HPLC图谱

图3 三味益肝颗粒样品HPLC图谱

2.4 提取溶剂的选择:取本品适量，研细，取约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取本品适量，研细，取约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，密塞，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

精密吸取上述溶液各10μL，按拟定的色谱条件进样，结果如下:

表1 提取溶剂的考察结果

2.5 线性范围考察精密称取丹参素钠对照品于25mL量瓶中加甲醇稀释至刻度。精密吸取上述对照品溶液1、2、3、4、5mL 置10mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得 41.2，22.4，123.6，164.8，206μg·mL－1的对照品溶液，分别进样10μL，测得色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程:

Y=4009X －4235 ，r=0.9999。试验结果如下:

表2 线性范围考察结果

试验结果表明丹参素钠在 41.2 ～206μg·mL－1范围内与峰面积程良好的线性关系。

2.6 稳定性性试验:取样品(批号081211)研细，取粉末0.5g，精密称定，按正文［2.3溶液的制备］项下制备供试液，精密吸取同一供试液，分别于0、2、4、6、8 h进样分析，测定色谱峰面积，测定结果见表3。

表3 稳定性试验考察结果

试验结果提示:供试液制备后8h内测定，色谱峰面积无明显变化，在此时间内，待测组分化学性质稳定。

2.7 精密度试验:取同一份供品溶液10μl，连续进样5次，记录色谱图。结果如下:测定结果表明，本品精密度试验符合有关规定。

表4 精密度试验测定结果

2.8 重复性试验:取本品(批号081211)，研细，分别取粉末2.0g，5份，精密称定，分别按正文［2.3溶液的制备］项下方法操作，测定，测定结果见表10。

表5 重现性试验测定结果

测定结果表明，本试验重现性良好。

2.9 回收率试验考察:精密称取本品(批号081211，含量2.00mg·g－1)5份，分别精密加入对照品于样品中，按［2.3溶液的制备］项下制备供试品溶液，按上述色谱条件依法测定，结果如下:

表6 回收率试验测定结果

测定结果提示:本方法回收率在99.79% ～102.3%之间，RSD为0.24%，符合有关规定。

表7 样品中丹参素钠含量

2.10 样品含量测定数据:经采用［2.3溶液的制备］项下方法，测定十批样品中丹参素钠的含量，测定结果见下表。

本品工艺摸索中，10批丹参药材丹参素含量均高于3%，因此确定丹参含量限度为本品含丹参素不得少于3%。

根据上述测定结果，参照工艺中制定的丹参含量限度，我们取总平均含量的80%作为本制剂丹参素的限量确定本品每袋含丹参以丹参素计不得低于2.2mg。

3 讨论

3.1 本制剂处方处方中的丹参含有丹参酚酸，丹参酮Ⅱ和丹参素等成分，但前两者为醇溶性物质，而本制剂为水提，所以选用水溶性的丹参素来测定本品的含量。

3.2 检测波长的选择:经紫外光谱扫描丹参素钠在281nm有最大吸收，故选用281nm为检测波长。

3.3 流动相的选择:参照《中国药典》2005年版一部丹参药材含量测定项下及文献报道［1］，采用甲醇－乙腈－磷酸三乙胺水溶液(5:2:93)和甲醇－乙腈－磷酸三乙胺水溶液(5:1:94)为流动相，进行色谱图分析，通过实验发现后者较前者分离效果好，丹参素钠与杂质峰分离度符合规定。故选用甲醇－乙腈－磷酸三乙胺水溶液(5:1:94)为流动相。

3.4 样品提取方法的选择［2－4］:三味益肝颗粒丹参中丹参素的提取受提取溶剂影响较大，如在相同的提取时间下分别用甲醇及稀乙醇作为提取溶剂，可发现两种溶剂提取丹参素钠含量相差较大，用甲醇提取较为完全，故选用甲醇为提取溶剂。

方法学研究表明，采用HPLC法对处方中丹参的丹参素含量进行测定，结果准确，重复性好，可作为三味益肝颗粒质量控制指标之一。

［1］中华人民共和国国家药典委员会.中国药典［S］.2005年版

［2］陈发奎.常用中草药有效成分含量测定［M］.人民卫生出版社1997.

［3］中华人民共和国国家药典委员会.卫生部药品标准(中药成分制剂)［S］.1998.50.

［4］阴健，郭力弓.中药现代研究与临床应用(1)［M］.北京:学苑出版社，1995.168，196，352，468.