测定金银花中6种有机酸类化合物含量的一种新方法

李文龙，张文明，薛东升，陈 俊，瞿海斌

(1.浙江大学药物信息学研究所，浙江 杭州 310058;2.上海凯宝药业有限公司，上海 201418)

中药成分的复杂性决定了必须采用多成分含量测定、多指标质量评价的模式对其进行质量控制，建立这种分析方法需要有多种对照品建立标准曲线，但是部分中药标准品存在分离难度大、单体不稳定、难以供应或供应价格高等问题，使得该模式仅限于少数科研项目，而难以推广到工业生产上。为解决这一问题，王智民等［1-3］提出，通过测定一个易得对照品成分的含量，求出其它药效成分对应于这一标准品的校正因子，来实现多个成分的“一测多评法”，尤其是对照品匮乏成分的测定。该方法可实现在对照品短缺的情况下，进行多指标成分的含量测定。此法经实践验证，具有可行性和技术适应性，已被采纳录入2010版《中国药典》［4］，目前有白芍、黄芩等药材［5-12］以及喜炎平、冠脉康胶囊等中成药［13-14］的相关研究报道。

金银花(Lonicerae Japonicae Flos.)为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或带初开的花，味甘、性寒，为常用中药，具有清热解毒、疏散风热的功效。有机酸类化合物是金银花的主要有效成分，包括咖啡酸(CfA)、绿原酸(CA)、新绿原酸(NCA)和异绿原酸等，其中异绿原酸为一种混合物，它的异构体有6种，分别为 4，5-二咖啡酸酰奎尼酸(4，5-DCA)、3，4-二咖啡酸酰奎尼酸(3，4-DCA)、3，5-二咖啡酸酰奎尼酸(3，5-DCA)、l，3-二咖啡酸酰奎尼酸、3-阿魏酰垒尼酸和 4-阿魏酰奎尼酸［15］。除绿原酸和咖啡酸外，其余标准品由于分离纯化比较困难，价格昂贵，难以应用到常规分析中。本研究以金银花药材为例，通过对其中CA和CfA含量的测定，实现了对其它4种有机酸类化合物(NCA、3，4-DCA、4，5-DCA、3，5-DCA)的含量测定，效果较为满意。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);MILLIPORE超纯水器(美国Millipore公司);KQ-250B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);METTLER AE240电子天平(梅特勒-托利多公司);FL-027高速台式离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 试药 实验用乙腈、甲酸均为色谱纯，水为超纯水。CA、CfA对照品购自中国药品生物制品检定所，NCA、3，4-DCA、3，5-DCA、4，5-DCA由本实验室自制，纯度均＞95%。金银花药材样品由上海凯宝药业有限公司提供。

2 方法与结果

成分的浓度与检测器响应在一定的范围内成正比，即f=W/A(其中，W 表示浓度，A表示响应值)。本研究在金银花的多指标含量测定时，分别以绿原酸和咖啡酸为参照物，计算其它成分的相对校正因子。在实际测定时，用外标法测定绿原酸或咖啡酸，再通过校正因子计算其它化学成分的含量。同时，用常规方法进行同步测定，以验证计算值的正确性和可行性。相对校正因子的计算方法［7］:

其中:s，k分别代表内参物和其它待测成分。

2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent ZORBAX SBC18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。流动相:A 相为0.1%甲酸-水，B 相为 0.1% 甲酸-乙腈，采用二元梯度洗脱，洗脱程序为0～25 min，B相:8%～8%;25～30 min，B相:8% ～19%;30～60 min，B相:19% ～19%。另外，流速:1 ml·min-1，检测波长:280 nm，柱温:25℃，进样量:10μL。在此色谱条件下，所得混合标准品和样品的色谱图如图1所示。

图1 混合标准品(A)及金银花药材提取液(B)的HPLC色谱图Fig.1 The characteristic chromatograms of the mixed standards(A)and sample solution(B)

2.2 对照品溶液制备 精密称取 CA、CfA、NCA、3，4-DCA、4，5-DCA、3，5-DCA 标准品适量，用50%的甲醇配制成单个标准品储备液，分别精密量取各储备液适量，配制成混和标准品储备液，并稀释成系列浓度的混和标准品。以上6种有机酸在混合标准品储备液中的质量浓度分别为 0.960、1.05、0.975、0.435、0.945、0.870 mg·ml-1。

2.3 供试品溶液制备 精密称取1 g金银花药材粉末置于25 ml容量瓶中，用50∶50的甲醇:水定容至刻度，超声提取2 h，取提取液1 ml，在 10 000 r/min 下离心 10 min，取 10μL上清液用于液相分析。

2.4 精密度实验 在线性范围内，分别进行日内精密度(1 d内连续分析6次)和日间精密度(3 d内每天分析1次)的考察。结果表明，6种有机酸的日内精密度RSD均＜3%，日间精密度RSD均＜5%。表明该方法具有满意的精密度。

2.5 重复性考察 精密称取同一批次金银花药材粉末6份，按照2.3项下的方法进行提取，提取液依次进行HPLC分析。在该色谱条件下，各有机酸类成分的重复性RSD均＜5%(表1)，表明该定量方法的重复性良好。

表1 重复性考察结果Table 1 The repeatability parameters of the established HPLC method

2.6 稳定性考察 将供试品溶液置于室温下，分别在0、2、4、8、16、24 h 后进样分析，结果见表2。在该色谱条件下，各有机酸类成分的稳定性RSD均＜5%，表明在24 h以内，各有机酸类成分在溶液中的含量稳定。

2.7 加样回收率考察 按加样回收率的测定方法，在已知含量的供试品溶液中，加入适量的混合标准品溶液，进样分析，平行制备6份，计算平均回收率，6种有机酸的平均回收率分别为:97.7%、102%、99.1%、98.6%、101%、98.5%，表明在该色谱条件下，该定量方法的加样回收率良好。

2.8 相对校正因子计算 对不同进样体积的混合标准品进行分析，分别以绿原酸和咖啡酸为参照物，按2.1项下公式计算出其它目标化合物的相对校正因子，结果见表3。

表2 稳定性考察结果Table 2 The stability parameters of the established HPLC method

表3 相对校正因子计算结果Table 3 The computing results of the relative correction factors

2.9 校正因子重现性考察 试验分别考察了Waters和Agilent 1100两种高效液相色谱系统和 Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、Alltech Alltima-C18(250 mm × 4.6 mm，5μm)和 Tigerkin C18(200 mm × 4.6 mm，5.0 μm)三种色谱柱。精密吸取混合对照品溶液5、10、15 和 20μL进样分析，每个浓度进样 3次，取平均值。以绿原酸为参照物计算相对校正因子，所得的相对校正因子及其相对标准差。表4显示，不同的仪器及不同的色谱柱所得的相对校正因子差异并不显著。在浙江大学药物信息学研究所(实验室1)和上海凯宝药业股份有限公司化验室(实验室2)均采用 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱进行一测多评试验，进样量为10μL，各测3次，测得的相对校正因子见表5，RSD在0.8% ～3.8%之间，这表明不同实验室所测得的相对校正因子差异较小。

表4 不同仪器和不同色谱柱上测得的相对校正因子Table 4 The relative correction factors calculated with different HPLC instruments and chromatographic columns

表5 不同实验室测得的相对校正因子Table 5 The relative correction factors determined in different laboratories

2.10 一测多评法与外标法的比较结果 分别以绿原酸和咖啡酸为内参物质，用所建立的一测多评法测定了金银花药材中其他有机酸的含量，并用外标法进行验证，结果列于表6中。对测试结果进行方差分析，得到 NCA、3，4-DCA、3，5-DCA、4，5-DCA 对应的 P 值分别为1.000、0.798、1.000、0.998，表明一测多评法与外标法测定结果之间不存在显著性差异。

表6 采用一测多评法与外标法测得的金银花药材的含量平均值Table 6 The average content values of the Lonicerae Japonicae Flos samples via QAMS and external standard method

综上所述，在对照品缺乏的情况下，以外标法测定CA或CfA，利用相对校正因子实现对金银花药材中其它有机酸的含量测定是可行的。该类方法可大大降低分析成本，提高工作效率，将其收入药典，符合质量可控的目标性原则、准确灵敏的科学性原则和简便实用的合理性原则。目前2010版中国药典中仅有黄连药材的质量控制采用这一方法，期望在下一版药典中能有更多的药材采用这一方法进行质量控制。

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