异莲心碱对大鼠CYP3A酶活性的影响

南 李，宣贵达

(1.浙江大学药学院，浙江 杭州 310058;2.浙江大学城市学院，浙江 杭州 310015)

异莲心碱(Isoliensinine，IL)是从睡莲科植物莲的莲子心中分离的一种生物碱单体，具有降压、抗心律失常、改善心血管功能、抗氧化等功能［1］，有广泛的应用前景。两种或两种以上药物合用时，可能在代谢环节产生作用的干扰，对CYP3A活性具有明显影响的药物与CYP3A底物联合应用时，可能会导致临床上出现严重的药物相互作用。研究药物对CYP3A活性的影响可预测其与其它药物发生药物相互作用的可能性。本研究采用大鼠肝微粒体混合酶体外代谢体系，以睾丸酮为探针［2］，建立HPLC检测CYP3A酶代谢活性，并利用该体系研究异莲心碱对 CYP3A酶活性的影响，以评估其与CYP3A底物合用时产生药物相互作用的可能性。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，Spectrum lab 52型紫外分光光度仪(上海棱光技术有限公司)，高速冷冻离心机(AllegraTM64R Centrifuge)，超高速离心机(OptimaTMMAX-XP Ultracentrifuge，贝克曼库尔特实验系统有限公司)。

1.2 实验动物 SD大鼠，雄性，体重(170±10)g，由浙江省医学科学院提供。

1.3 试剂和中药供试品 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，氧化型辅酶II，6-磷酸葡萄糖单钠盐，睾酮(sigma公司);牛血清白蛋白(杭州四季青公司);甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯，上海凌峰化学试剂公司);苯巴比妥钠注射液(规格0.1 g/ml，天津金耀氨基酸有限公司)，异莲心碱(含量≥94.0%，南京德宝升华器材有限公司提供，上海同田生物技术有限公司检验)。

供试品的配制方法:精密称取异莲心碱10.28 mg，用 1 ml甲醇超声溶解配制成 200、100、50、25、12.5 μmol/L 5 个浓度。

2 方法

2.1 大鼠肝微粒体制备 选取SD大鼠4只，第1天注射3 g/L的苯巴比妥钠注射液2 ml，第2～4天注射6 g/L的苯巴比妥钠注射液2 ml，并于第4天晚上开始将大鼠禁食12 h，于最后一次给药后24 h内处死动物。按文献［3］所述方法，采用超高速离心法制备大鼠肝微粒体，并将所得肝微粒体悬浮液置于-80℃保存备用。以上操作均在4℃以下进行。采用Lowry法［4］测定微粒体蛋白含量，蛋白浓度1.2 mg/ml。

2.2 肝微粒体混合酶系配制方法 取1.2 mg/ml肝微粒体 2.4 ml，0.4 mol/L MgCl2240μL，1.65 mol/L KCl 240μL，6-磷酸葡萄糖单钠盐 36.48 mg，氧化型辅酶Ⅱ 72.03 mg，6-磷酸葡萄糖脱氢酶(10 U/ml)240μL，去离子水9.12 ml，0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=7.4)12 ml，配制成24 ml孵育体系。混合酶系配制均在冰浴上进行，现配现用。

2.3 CYP3A酶代谢活性检测 取上述肝微粒体混合酶系 0.2 ml，加入底物 200 μmol/L 睾酮5μL。在37℃条件下孵育，孵育结束后，加入0.2 ml冰冷甲醇终止反应。置2℃下1 h，使蛋白沉淀。12 000 r/min离心5 min，取上清液，0.22 μm有机微孔膜过滤，HPLC进样，检测睾酮的减少量，表示为CYP3A酶活性。

2.4 HPLC检测条件 大连依利特 Hypersil BDS C18(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流动相 A:乙腈-水(53∶47)。流速 1 ml/min，柱温 30℃，波长 245 nm，进样量 25μL。

对照品溶液配制:将睾酮用甲醇稀释，得到0.2、0.5、1、2、5、10、30、60、150、300 μmol/L 的标准溶液，进行HPLC测定，绘制标准曲线。

2.5 异莲心碱对CYP3A的影响 取试管分成空白组、睾酮组、睾酮加不同浓度异莲心碱组，每种试验条件做3个平行管，试验均重复3次。所有试管中均加入肝微粒体酶系0.2 ml。除此之外，空白对照管中加入相应的溶媒5μL，睾酮组加入200 μmol/L睾酮5μL;睾酮加异莲心碱组除了加入200 μmol/L睾酮 5μL外，再加入不同浓度的异莲心碱5μL。混匀，按3.5项下条件孵育，加入0.2 ml冰冷甲醇终止反应。将试管置于4℃下1 h使蛋白沉淀，以12 000 r/min 离心5 min，取上清，用 0.22 μm 有机微孔膜过滤，HPLC进样。

2.6 计算方法 Km和Vmax计算:根据Lineweaver Burk方程，通过代谢产物量与代谢时间和蛋白浓度的比值求得。

异莲心碱对CYP3A4的抑制率(IC50)计算:首先按照以下公式计算不同浓度 IL对CYP3A的抑制率:抑制率(%)=(加IL睾酮减少量-不加IL睾酮减少量)/加IL睾酮减少量×100%。然后采用线性回归计算IC50。

3 结果

3.1 色谱图 通过调节流动相的比例，根据色谱条件2.4项下，睾酮的分离度好，峰形较对称且柱效高，睾酮出峰时间在6.025 min左右(图1)。

图1 睾酮色谱图Fig.1 Chromatogram of testosterone

3.2 睾酮标准曲线的绘制 以睾酮浓度为横坐标(C)，不同浓度所测得的峰面积为纵坐标(AUC)，得标准曲线:AUC=47.283C+12.65，r2=0.9995(n=10)。睾酮在 0.001 ～2.16 μg呈良好的线性关系。

3.3 睾酮回收率考察 取18支试管，分成6组，每组3个平行管，重复3次。空白组试管中加入甲醇 100μL，同时分别加入 50、100、200 μmol/L的睾酮100μL。样品组试管中各加入微粒体孵育体系 100μL，同时分别加入 50、100、200 μmol/L 的睾酮 100μL。将上述试管置于37℃中孵育3.5 h后，12 000 r/min离心5 min。以空白孵育体系液提取后测得的峰面积，与对应的对照品甲醇所测得的峰面积比较，获得提取回收率。结果显示，提取回收率在95%～104%，符合回收率在95% ～105%的测定要求，且RSD也符合在0.01% ～5%的测定要求(表1)。

3.4 睾酮精密度考察 选取分别为0.1、35、200 μmol/L低、中、高3个浓度的睾酮，每个浓度5份样品，分别在5 d内连续测定其浓度，每天以第1针进样开始计算时间，每个浓度分别在0，2，4，6，8 h 进样 5 次，每次进样体积 25μL，连续进样5 d。计算日内、日间误差精密度(RSD)。精密度用相对标准偏差(RSD)表示，结果该法的日内和日间RSD在0.01% ～2%(表2)。

3.5 睾酮体外代谢条件考察

3.5.1 不同孵育时间对睾酮代谢的影响 取上述肝微粒体混合酶系0.2 ml，加入底物200 μmol/L 睾酮 5μL，在 37℃ 条件下孵育不同时间，待孵育结束后，加入0.2 ml冰冷甲醇终止反应，测定睾酮的减少量。从图2中可知，孵育210 min时睾酮的代谢量最大。

表1 睾酮回收率Table 1 Recovery of testosterone

表2 睾酮的日内和日间精密度Table 2 Within-day precision and day to day precision of testosterone

图2 孵育不同时间睾酮的量Fig.2 Amount of testosterone in different time during incubation

3.5.2 不同底物浓度对睾酮代谢的影响 取上述肝微粒体混合酶系0.2 ml，加入不同浓度的底物睾酮，在37℃下孵育210 min，待孵育结束后，加入0.2 ml冰冷甲醇终止反应，测定睾酮的减少量。从图3中可知，睾酮25～200 μmo/L内，睾酮的减少量与浓度成正相关。当底物浓度为200 μmo/L左右时，睾酮的代谢量最大。以睾酮浓度为横坐标(X)，不同浓度下睾酮减少值为纵坐标(Y)，通过计算得方程Y=0.4593X+0.0148，Vmax=31.25 μmol/(L·h)，Km=14.35 μmol/L。

图3 不同底物浓度下睾酮减少值的变化Fig.3 The variation of Reduction of testosterone in different concentration of substrate

3.6 IL对CYP3A4酶活性的影响 在体外肝微粒体混合酶系中，当磷酸盐缓冲液浓度为0.2 mol/L，pH 为 7.4，温度为 37℃，底物睾酮浓度为200 μmol/L，孵育时间为210 min时，异莲心碱对睾酮代谢的影响见表3。IC50＞1 000 μmol/L，抑制能力较弱。

表3 异莲心碱对睾酮代谢的影响(，n=3)Table 3 The influence of IL to the metabolism of testosterone

表3 异莲心碱对睾酮代谢的影响(，n=3)Table 3 The influence of IL to the metabolism of testosterone

异莲心碱/μmol·L-1睾酮减少量/μg相对抑制率/%IC50/μmol·L -1 0 2.36 ±0.01 - ＞1000 12.5 2.32 ±0.01 1.6 25 2.20 ±0.01 6.8 50 2.30 ±0.01 2.5 100 2.23 ±0.01 5.5 200 2.45 ±0.01 3.8

4 讨论

近些年来，在世界范围内，中药的应用日益广泛，中药与西药合用的机会越来越多。研究表明，中药或中药提取物可能影响肝脏代谢酶活性，从而可能产生药物-药物相互作用，如当抗凝药华法林和银杏、大蒜、当归、丹参合用时会导致严重岀血［5］。据报道，因同时服用华法林和酸果蔓汁导致了一名70岁的老人胃肠道和心包出血而死亡［6］。因此，有必要加强中西药相互作用的研究，以指导临床的合理用药。

目前，国内外学者已逐步建立了一系列体内体外的实验室方法，用于有关药物代谢的研究。采用特异性抗体、特异性诱导剂和抑制剂等作为探针，观察代谢物生成量变化，是目前最常用的试验方法。实验应以观察代谢物生成量变化较为准确，但因本实验所需睾酮代谢产物6β-羟基睾丸酮国际市场不存在现货，故采取观察睾酮减少量变化这一方法来进行初步的数据分析。当实验结果表明有明显诱导或抑制作用时，再用其他方法进一步检测，比较快速简便。

本实验考察了不同孵育时间和底物浓度对大鼠CYP3A酶代谢的影响，其他如pH、温度、磷酸盐浓度等都采用接近于人体内环境的条件，最终选择了孵育时间210 min和底物浓度200 μmol/L。判断一种药物是否是酶抑制剂常用参数 IC50和 Ki。当 IC50＞50 μmol/L，说明药物对该 CYP酶系抑制能力弱，无需再计算Ki值。

［1］SHANG Jing，PAN Yang(商 晶，潘 扬).Recent researches on chemical and pharmacological of Isolien ［J］.Journal of Nanjing TCMUniversity(南京中医药大学学报)，2010，26(3):238-239.(in Chinese)

［2］RAE Y，MADANIS，WEI X X，et al.Evaluation of cytochromeP450 probe substrates commonly used by the pharmaceutical industry to study in vitro drug interactions［J］.Drug Metab Dispos，2002，30(12):1311-1319.

［3］SANDERINK G J，BOUMIQUE B，STEVENS J，et al.Involvement of human CYP1A isoenzymes in the metabolism and drug interactions of riluzole in vitro［J］.Pharmacol Exp Ther，1997，282(3):1465-1466.

［4］LOWRY O H，ROSEBROUGH N J，FARR AL，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.Biol Chem，1951，193:265-275.

［5］ADRIANE F B.Herb-Drug Interactions ［J］.Lancet，2000，355:134-138.

［6］SUVARNA R，PIRMOHAMED M，HENDERSON L.Possible interaction between Warfarin and cranberry juice ［J］.British Medical Journal，2003，327:1454.