半胱氨酰白三烯受体1参与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的调节

余舒莹，赵 冰，张霞燕，张晓燕，王艳芳，张丽慧，卢韵碧，魏尔清

(1.浙江大学医学院药理学系，浙江杭州 310058;2.杭州师范大学基础医学部药理学教研室，浙江杭州 310036)

鱼藤酮是一种广泛应用于农业的杀虫剂，在体外能损伤多巴胺能神经元［1-2］，产生与帕金森病(Parkinson's disease，PD)病理特征相似的表现［3］。鱼藤酮作为一种细胞毒性化合物，是特异性线粒体复合体I抑制剂，可选择性地阻断铁-硫簇N2和泛醌Q的作用，导致线粒体呼吸链电子转运障碍，造成氧化应激及ATP生成障碍，从而引起细胞损伤［4-5］。PC12细胞作为常用的PD细胞模型，是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，其合成的酶类、表达的受体以及合成的神经递质接近中脑多巴胺(dopamine，DA)神经元［6］，已被广泛用于 DA神经元体外研究，特别是用于PD发病机制的研究。

花生四烯酸经5-脂氧酶催化而生的成半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)，包括LTC4、LTD4和LTE4，是一类活性很强的炎症介质，其作用由 CysLT1和 CysLT2受体介导［7］。CysLTs经PD诱变剂鱼藤酮处理后，可激活 PC12 细胞 5-脂氧酶［8］，表明 CysLTs可能参与PD病变。鱼藤酮还能增加小鼠小胶质细胞株BV2细胞CysLT1受体表达，提示CysLT1受体参与PD的炎症调节过程［9］。本实验室以往的研究表明，脑缺血性损伤后，脑内CysLT1表达增加［10］;CysLT1受体拮抗剂普鲁司特和孟鲁司特对脑缺血性损伤有保护作用［11-14］。但是，DA神经元CysLT1受体是否也参与PD病变过程，CysLT1受体拮抗剂能否保护鱼藤酮诱导的神经元损伤尚待研究。本研究观察CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特对鱼藤酮引起PC12细胞损伤的作用，以及鱼藤酮引起CysLT1受体的表达、分布变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 胰酶、多聚赖氨酸、鱼藤酮、青霉素、链霉素、二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自美国Sigma公司;DMEM高糖培养基和马血清购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司;兔抗小鼠CysLT1受体多克隆抗体由本研究室制备［11］;异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG、CY3标记的山羊抗兔IgG购自美国Chemicon公司;孟鲁司特(montelukast)由美国Merk公司赠送。BX51荧光显微镜购自日本Olympus公司;CO2培养箱购自美国Forma Scientific公司;多波长酶标仪(Elx800 Universal Micro-plate Recorder)购自美国 Bio-TEK公司;SDS-PAGE胶电泳转膜装置购自美国 BIORAD公司;ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统购自美国LI-COR Biosciences公司。

1.2 细胞培养 高分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基(含青霉素105U/L、链霉素105μg/L)，在5%CO2培养箱37℃培养，2～3 d传代，相近代数的细胞用于实验。当细胞铺满培养瓶底面积80%～90%时，以0.25%胰酶消化3～4 min，将细胞收集到离心管中，1 000 r/min离心5 min后，弃上清。加入培养基重悬细胞，接种在96孔和24孔中的细胞浓度分别为4 ×103/孔、2.5 ×l04/孔。细胞接种24 h后，进行不同处理。

1.3 确定鱼藤酮处理损伤浓度［15］及形态观察、活性测定(MTT法)［16］PC12细胞种于96孔板，贴壁生长24 h后，分别加入不同浓度鱼藤酮(终浓度 0.3、1、3、10、30 μmol/L)，对照组换用培养液，然后放入5%CO2培养箱培养24 h。在光学显微镜下观察细胞形态并摄影。

为测定细胞活性，处理结束后小心吸弃96孔板每孔的培养液，加入100μL MTT溶液(0.5 mg/ml，DMEM 培养基配制)，在 5%CO2培养箱37℃继续孵育2 h后，小心吸弃上清液，每孔加入100μL DMSO中止反应，振摇使生成的formazan颗粒充分溶解，用酶标仪测定波长570 nm处吸光值(OD570)，OD值大小反映细胞的存活，以正常对照组MTT吸光值为基数100%，以药物处理组与正常对照组吸光值的百分比，计算存活细胞百分率。

1.4 Western blotting测定CysLT1受体蛋白用胰酶消化收集鱼藤酮处理后的PC12细胞，以常规方法提取总蛋白，用考马斯亮蓝法做标准曲线，测定提取液中的蛋白浓度。取100 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，先以100 V恒压使Marker分开，再以150 V恒压继续电泳，直至溴酚蓝条带到达分离胶底部。然后，300 mA电转移90 min至硝酸纤维素膜，经TBST漂洗后，放入含5%脱脂奶粉中，平放在平缓摇动的摇床平台上，室温孵育120 min。取出硝酸纤维素膜，放入混有GAPDH(小鼠单克隆抗体1∶5000)及CysLT1受体(1∶500)的一抗中，4℃冰箱中过夜，再用TBST漂洗10 min，共3次，与抗兔IRDye700DX®偶联或抗鼠IRDye800DX®偶联的二抗(1∶5000)室温孵育2 h，漂洗后，用凝胶成像系统摄像，利用Quality One软件以GAPDH为内参，结果以CysLT1受体和GAPDH的条带光密度比值相对百分比表示。

1.5 免疫细胞化学检测细胞CysLT1受体的分布 PC12细胞种于24孔板的盖玻片上，贴壁生长24 h后，细胞经不同浓度鱼藤酮处理24 h及3 μmol/L鱼藤酮处理不同时间后，收集玻片，以0.01 mol/L PBS轻轻漂洗，冰甲醇冰上固定 5 min，再用 0.01 mol/L PBS清洗3次，加5%非免疫羊血清室温封闭2 h。每孔各加一抗(1∶500)，4℃孵育过夜;次日，PBS清洗3次后，加抗兔FITC标记(绿色)或CY3标记(红色)的荧光二抗(1∶200)，在室温下孵育2 h，PBS清洗3次，并用碳酸甘油缓冲液(含1∶1000 DAPI，染细胞核)封片。在荧光显微镜下观察CysLT1受体在PC12细胞上的分布并摄影。

2 结果

2.1 鱼藤酮诱导PC12细胞损伤变化 鱼藤酮(终浓度 0.3、1、3、10、30 μmol/L)处理 PC12细胞24 h后，光镜下可见，随着鱼藤酮浓度的增大，细胞出现明显的形态学改变，包括细胞突起变短、消失，细胞萎缩、变圆(图1A);细胞活性明显降低，分别降低至对照值的91%、81%、76%、76%、75%(P ＜0.05 ～0.01，图 1B)。鱼藤酮3 μmol/L的作用24 h的变化明显、适度，因此，选择该条件作为诱导PC12细胞损伤的条件。

2.2 CysLT1受体拮抗剂对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的影响 常规培养条件下，孟鲁司特0.2、1、5 μmol/L 作用24 h，对细胞活性没有明显影响，而 10 μmol/L轻度增高细胞活性［100.0 ±2.3 vs 106.3 ±4.5(%)，P ＜0.01，图2A］。孟鲁司特 0.2 ～10 μmol/L 预先孵育PC12细胞30 min，再用3 μmol/L鱼藤酮处理24 h，结果表明1、5 μmol/L 孟鲁司特可显著抑制鱼藤酮诱导的细胞活性降低［100.0±2.9 vs 103.7 ± 3.1、98.8 ± 4.3(%)］，而 0.2、10 μmol/L孟鲁司特无显著抑制作用［100.0±2.9 vs 90.9 ± 2.8、77.1 ± 4.5(%)，P ＜ 0.05 ～0.01，图 2B］。

2.3 鱼藤酮引起PC12细胞CysLT1受体表达的变化 Western blotting检测结果表明，PC12细胞在正常条件下表达CysLT1受体(条带约43 kD，图 3A);鱼藤酮 1、3、10 μmol/L 处理 24 h后，PC12细胞表达CysLT1受体表达显著增加［100 ± 4.4 vs 135.7 ± 6.3、146.9 ± 5.8、118.1±5.5(与 GAPDH 的比值)，P ＜0.05，图 3A］。鱼藤酮3 μmol/L 作用3、24 h 后，CysLT1受体表达显著增多［100 ±4.2 vs 155.4 ±5.6，153.3 ±5.7(与 GAPDH 的比值)，P ＜0.05，图3B］。

2.4 鱼藤酮诱导PC12细胞CysLT1受体分布的改变 本实验结果显示，CysLT1受体正常情况下主要分布在细胞核;经0.003 μmol/L鱼藤酮处理24 h后CysLT1受体分布未发生明显变化，但 0.01 μmol/L 以上鱼藤酮处理 24 h后，CysLT1受体趋向分布于胞浆(图 4A)，当 3 μmol/L鱼藤酮处理从25 min开始，CysLT1受体分布发生变化(图4B)。

3 讨论

本研究结果表明，鱼藤酮0.3～30 μmol/L处理24 h，可浓度依赖性降低PC12细胞活性，并改变细胞形态。CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特对鱼藤酮诱导损伤的保护作用，提示CysLT1受体可能参与PC12细胞的PD样变化。孟鲁司特的作用表现“钟形”量效关系，即1、5 μmol/L能有效减轻细胞损伤，而 0.2、10 μmol/L 则无明显减轻作用，这一结果与脑缺血整体动物实验结果［14］相似。

CysLT1受体表达、分布特点进一步证实其与鱼藤酮损伤的关系。鱼藤酮1～10 μmol/L作用 24 h后，CysLT1受体显著增加，但 30 μmol/L未显示该作用。鉴于鱼藤酮慢性中毒诱导PD病变时能到达脑内的浓度可能较低，因此，CysLT1受体可能在PD发生中起调节作用。鱼藤酮3 μmol/L诱导CysLT1受体表达的时间过程具有“双峰”特点，即在3 h及24 h存在表达高峰，提示CysLT1受体可能介导急性和后期效应。在大鼠局灶性脑缺血后，缺血中心区在3～12 h及7～14 d也有2个CysLT1受体表达高峰，分别介导急性神经元损伤和后期小胶质细胞激活［10］。在本实验离体条件下，很可能由于鱼藤酮诱导早期代谢障碍，促进CysLT1受体表达并介导PC12细胞损伤;而后期(24 h)由于细胞因子等释放促进CysLT1受体表达，参与炎症相关的变化。这一双峰表达的机制和意义，还有待阐明。

免疫组化结果证实，正常情况下 CysLT1受体主要分布于PC12细胞的细胞核内，随鱼藤酮作用浓度的升高，CysLT1受体移位到胞浆;3 μmol/L鱼藤酮作用的时间过程表明，从25 min开始，CysLT1受体就发生明显的移位。在结肠癌细胞中，CysLT1受体也主要分布在核内［17］，其意义尚未阐明，但认为与细胞增殖反应有关［17］。在 BV2 细胞，鱼藤酮浓度依赖性诱导CysLT1受体核移位［9］，可能与小胶质细胞激活相关;但鱼藤酮对PC12细胞表现损伤作用，其诱导的CysLT1受体移位特点有别于BV2细胞。CysLT1受体的这种移位特点，与PC12细胞损伤究竟有什么关联，还需要进一步研究。

综上所述，本研究证明CysLT1受体参与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤，CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特可减轻鱼藤酮诱导的细胞损伤，其机制还有待进一步研究。

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