化学药物诱导的大鼠急性肾损伤模型中肾损伤分子-1表达的研究*

汪蓓蕾 张 瑞 刘 妍 张金晓 郭 刚

近年来，国际肾脏病及急救医学界趋向用急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）来取代传统的急性肾衰竭（acute renal failure，ARF）这一概念，以强调对尚未进入肾衰竭阶段的急性肾功能异常患者进行早期诊断和早期处理的重要性[1]。因此，选用易定量、高敏感性和可早期预测的肾损伤标志物至关重要。肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，Kim-1）是一类Ⅰ型膜转运蛋白，包括胞浆区和含有Ig样结构域及黏蛋白域的胞外区，可能参与了肾脏疾病的损伤及修复过程[2]。本研究通过对肾损伤模型中肾Kim-1基因和蛋白水平的研究，旨在为以尿Kim-1作为预测早期肾损伤的生物标志物提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 顺铂、庆大霉素（Sigma公司）；环孢素（诺华制药）；Trizol、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶（Invitrogen公司）；DNA Marker DL-2000（精美生物工程公司）；SYBR green MIX（Takara公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）、二硫苏糖醇（DTT）、低熔点琼脂糖（天津博美科生物技术有限公司）；PCR引物（上海生工生物工程公司）；羊抗大鼠Kim-1多抗（R&D公司）；小鼠抗β-actin单抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（博奥森公司）；醋酸纤维素膜、ECL试剂盒（millipore公司）；Contifuge 17RS台式冷冻离心机（德国Heraeus公司）；GeneSnap凝胶图像采集分析系统（SynGene公司）；实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）仪、垂直板电泳仪（Bio-Rad公司）。

1.2 动物分组和造模 雄性SD大鼠36只，SPF级，10～12周，体质量220～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产单位许可证编号：SCXK（京）2006-0009。试验期间动物自由饮水，进食。SD大鼠按体质量分层后随机分为顺铂、庆大霉素、环孢素肾损伤组和各对照组，每组6只。

1.2.1 顺铂诱导肾损伤模型 顺铂肾损伤组腹腔注射顺铂7.5 mg/kg，给药体积为5 mL/kg，每日1次，连续给药6 d；对照组以相同方式给予生理盐水。取给药6 d后大鼠肾脏组织，液氮速冻后，-80℃保存备用。

1.2.2 庆大霉素肾损伤模型 庆大霉素肾损伤组腹腔注射庆大霉素120 mg/kg，给药体积为2 mL/kg，连续给药12 d，每日1次；对照组以相同方式给予生理盐水。取给药12 d后大鼠肾脏组织，液氮速冻后，-80℃保存备用。

1.2.3 环孢素肾损伤模型 环孢素肾损伤组1～22 d灌胃给环孢素30 mg/kg，23～43 d皮下注射给药17.5 mg/kg，44～52 d皮下注射给药30 mg/kg；对照组以相同方式给予生理盐水。取给药52 d后大鼠肾脏组织，液氮速冻后，-80℃保存备用。

1.3 组织病理学检查 肾组织经固定、脱水、石蜡包埋、切片（3 μm）后做常规HE染色。200或400倍光镜下，观察各组大鼠肾小管上皮组织形态的病理变化。肾小管病理变化由2个参数判定：（1）肾小管上皮细胞变性、坏死，小管扩张。（2）肾小管嗜碱性变。每个参数按0～4分评定：0分，正常；1分，极轻度受损，病变范围<25%；2分，轻度受损，病变范围25%～50%；3分，中度受损，病变范围51%～75%；4分，重度受损，病变范围>75%。

1.4 RT-PCR检测大鼠肾脏组织Kim-1基因的表达

1.4.1 总RNA的提取和反转录合成cDNA 取大鼠肾脏组织100 mg，采用Trizol一步法进行肾组织总RNA的提取。利用分光光度计测定总RNA的吸光度（A）值，根据A260/A280和A260/A230的比值鉴定总RNA纯度。利用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。各管分别加入2 μg总RNA样品，寡核苷酸Oligo（dT）181 μL（1 g/L），10 mmol/L dNTPs 1 μL，焦碳酸二乙酯（DEPC）水补齐，总体积12 μL。混匀后10 000 r/min瞬时离心5 s，65 ℃ 5 min后立即冰浴；加入5×Buffer 4 μL，0.1 mol/L二硫苏糖醇（DTT）2 μL，RNA酶抑制剂1 μL（40 U），混匀，37 ℃ 2 min，立即冰浴，再加入M-MLV 1 μL（200 U），总体积20 μL。混匀，10 000 r/min瞬时离心5 s，37 ℃ 50 min，70℃15 min，-20℃保存。

1.4.2 RT-PCR检测Kim-1及管家基因GAPDH的表达水平 各引物序列利用Gene Runner软件设计，经NCBI BLAST检索无显著同源性序列。Kim-1引物：上游5′-AG TCACCTATCGGAGCAG-3′，下游5′-GAACCATCCAGGAATC TC-3′， 扩增片段长度为135 bp；管家基因GAPDH：上游5′-A CAGCAACTCCCATTCTT-3′，下 游5′-TCCAGGGTTTCTTACT CC-3′，扩增片段长度为160 bp。采用Takara公司的SYBR green PCR试剂盒，反应体系：总体积20 μL，含SYBR green MIX 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2 μL，双蒸水 7.0 μL；反应条件为：95 ℃预变性1 min；95 ℃10 s、退火（Kim-l 58.1℃；GAPDH 56℃）10 s、72℃ 10 s，进行40个循环。通过测定PCR产物的动态累积量，获得样品的扩增曲线。接着进行熔解曲线分析：95℃0 s，65℃15 s，95℃0 s，用待测样品2-△CT值表示目的基因相对表达量[3（]CT是每个反应管内的荧光信号到达一定域值时所经历的循环数；样品△CT=目的基因CT值-GAPDH CT值）。RT-PCR扩增产物经2.0%琼脂糖电泳鉴定，测序交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.5 Western Blot法检测大鼠肾脏组织Kim-1蛋白

1.5.1 膜蛋白Kim-1的提取 取100 mg肾组织在600 μL RIPA裂解液[1×PBS，1%Nonidet P-40，0.5% 去氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）1 mmol/L，乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）及蛋白酶抑制剂1 mmol/L苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），20 μmol/L亮肽酶素]中充分匀浆后，12 000 ×g离心15 min后收集上清液。取少量上清利用PIERCE公司BCATM蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度，其余-80℃保存备用。

1.5.2 膜蛋白Kim-1的Western Blotting 以30 μg蛋白质与2X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液1∶1混合，100℃变性10 min，进行SDS-PAGE电泳。电泳后，将凝胶中的蛋白样本转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，用适量的封闭液（5%脱脂奶粉溶于含0.05%Tween20的Tris-HCl缓冲盐溶液TBS中），室温震荡1 h后4℃放置过夜。以wash buffer（含0.05%Tween20的TBS）清洗NC膜3次后将其置入一杂交袋中，加入封闭液稀释的山羊抗大鼠Kim-1多抗（1∶400），4℃震摇过夜。NC膜经wash buffer漂洗3次后，加入HRP标记的兔抗山羊IgG二抗（1∶5 000）溶液，37℃震摇孵育1 h。最后用ECL法曝光显影。DH-2000凝胶图像系统进行图像采集和数据处理。以β-actin作为内参照。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件处理试验数据，所得数据以±s表示。各实验组与其对照组之间比较进行t检验；不同实验组之间比较进行单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肾脏病理学改变 各药物对照组的肾组织结构均呈正常，见图1a、c、e；顺铂肾损伤组肾脏皮髓交界处均出现不等程度肾小管扩张，较多肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落，基底膜裸露，腔内有大量红染无结构的颗粒状物质，较多肾小管腔内有蛋白管型，见图1b，评分为3分。庆大霉素模型组大鼠肾小管扩张，肾皮质内大量肾小管变性、坏死，较多肾小管中可见蛋白管型，见图1d，评分为2.3分。环孢素模型组大鼠肾脏内较多肾小管发生轻度嗜碱性变，见图1f，评分为2分。镜检结果表明：由顺铂、庆大霉素及环孢素诱导的3个肾损伤模型均造模成功。

2.2 大鼠肾组织Kim-1及管家基因GAPDH RT-PCR扩增产物的鉴定 GAPDH、Kim-1 mRNA RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳后，分别在160 bp、135 bp处出现目的条带，见图2、3。同时，RT-PCR阴性对照（反转录合成cDNA第一链时以水代替M-MLV）无扩增产物，排除了所提取RNA中基因组DNA的存在，见图2。扩增产物测序结果与预期相符。

2.3 Kim-1和GAPDH的扩增曲线和熔解曲线 各组样品的扩增曲线呈明显的S形，曲线拐点清楚，而且在平台期几乎重合，说明获得的扩增曲线良好。各熔解曲线未见杂峰，也未出现主峰的异常增宽，同时熔解峰（主峰）对应的Tm（DNA的解链温度）值与扩增产物的理论Tm值相近，见图4。

2.4 化学药物诱导的肾损伤对肾组织中Kim-1 mRNA和蛋白水平的影响 各对照组肾Kim-1 mRNA表达水平显著低于相应肾损伤组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1。各模型组中均可检测到肾Kim-1蛋白阳性表达，而对照组中均未检测到，见图5～7。顺铂组kim蛋白表达水平最高，庆大霉素组次之，环孢素组最低，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

Table 1 Expression levels of Kim-1 mRNA of renal tissues between two groups表1 各组大鼠肾组织Kim-1 mRNA的表达水平（n=6，±s）

Table 1 Expression levels of Kim-1 mRNA of renal tissues between two groups表1 各组大鼠肾组织Kim-1 mRNA的表达水平（n=6，±s）

*P<0.05，**P<0.01

组别对照组肾损伤组t顺铂（4.45±1.08）×10-5（5.92±1.22）×10-2 7.465**庆大霉素（3.13±1.21）×10-4（8.39±2.65）×10-2 6.040**环孢素（2.29±1.21）×10-4（4.33±1.66）×10-3 2.656*

Figure 5 Results of Kim-1 protein expression detected by Western blot between DDP-renal injury model group and control group图5 顺铂诱导肾损伤模型组和对照组Kim-1蛋白Western bolt结果

Figure 6 Results of Kim-1 protein expression detected by Western blot between GM-renal injury model group and control group图6 庆大霉素诱导肾损伤模型组和对照组Kim-1蛋白Western bolt结果

Figure 7 Results of Kim-1 protein expression detected by Western blot between cyclosporine-renal injury model group and control group图7 环孢素诱导肾损伤模型组和对照组Kim-1蛋白Western bolt结果

Table 2 Expression levels Kim-1 protein of renal tissues between two groups表2 各组大鼠肾组织Kim-1蛋白的表达水平（n=6，±s）

Table 2 Expression levels Kim-1 protein of renal tissues between two groups表2 各组大鼠肾组织Kim-1蛋白的表达水平（n=6，±s）

**P<0.01

组别 Kim-1/β-actin 统计学处理P顺铂组（1）庆大霉素组（2）环孢素组（3）F 28.557±11.122 8.779±0.997 0.770±0.168 29.522**<0.001<0.001 0.048组比（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）

3 讨论

Kim-1在正常肾脏内微量表达，而在肾缺血或肾毒性急性损伤后会出现显著变化：去分化近端小管细胞（proximal tubular cells，PTC）内Kim-l基因转录水平急剧上调，Kim-l蛋白也随之大量表达，而随着结构与功能的恢复，Kim-1这种高表达的现象也会消失[1]。除AKI外，慢性的肾损伤过程，如蛋白负荷肾病[4]和血管紧张素Ⅱ诱导的肾病[5]也会导致肾近端小管上Kim-1表达量增高。目前，对肾损伤时高表达Kim-1所发挥的具体功能还不清楚。Ichimura等[6]发现，AKI时Kim-1在吞噬凋亡细胞的过程中起到重要作用。这也证实了Kim-1作为一种磷脂酰丝氨酸受体可以诱导对凋亡细胞的吞噬作用的研究[7]。另外，尿中Kim-1在双侧肾缺血10 min后的第1天就可发生显著性增高[8]，在急性肾小管坏死（acute tubule necrosis，ATN）时尿Kim-l能在镜下发现任何管型之前被检出，且可持续到恢复阶段；而在糖尿病肾病和系统性红斑狼疮肾病患者中，尿Kim-l在出现明显尿蛋白后也不会增加[9]。因此，尿Kim-l可成为检测早期肾损伤的可靠生物学标志物。

本研究选用3种作用机制不同但都有明确肾毒性的化学药物建立大鼠AKI模型。顺铂引起肾小管上皮细胞脂质过氧化、细胞内浆网钙泵的控制受干扰、细胞核内糖体蛋白质的合成受抑制、溶酶体功能抑制及细胞内凝血等[9]；庆大霉素通过膜蛋白受体GP330（glycoprotein 330）介导的阳离子蛋白或受体内吞饮作用进入肾小管上皮细胞，形成的囊泡与初级溶酶体结合，使溶酶体膜通透性增加，以致酶大量漏出，继而损害线粒体等细胞内结构[10]；环孢素诱导的肾毒性过程与前列腺素（PG）代谢失衡、肾素-血管紧张素系统激活、内皮素（ET）生成过多、一氧化氮（NO）量不足、反应性氧代谢产物（ROM）增加和肾脏抗氧化能力下降等因素有关[11]。在本研究中，3种药物都导致了大鼠肾脏肾小管上皮细胞不同程度的变性、坏死，同时，肾Kim-1 mRNA和蛋白含量也都发生了显著升高。顺铂组肾Kim-1在基因转录水平较对照组有约1 000倍的增高；庆大霉素诱导的肾损伤也造成了肾组织内的Kim-1 mRNA升高约260倍；环孢素肾毒性模型尽管在病理学上表现为较多肾小管轻度嗜碱性变，但其肾Kim-1基因转录水平增高了近19倍。由此可见，虽然3个模型的肾小管急性损伤由不同的机制导致，但是3个模型肾Kim-1 mRNA水平的增高程度随病理学病变评分高低有相同的变化趋势，且3组模型肾Kim-1蛋白表达水平亦然。

3种肾毒性药物除了导致肾Kim-1 mRNA水平和蛋白含量显著升高。Van等还发现尿中Kim-1含量与受损肾单元Kim-1蛋白表达量之间存在相关性的结论[4]；而有关Kim-1蛋白的细胞外域在基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）作用下裂解为可溶性片段而释放到细胞外并排入尿中的发现[12]，则说明了肾毒性药物诱导肾损伤时肾Kim-1的高表达与尿Kim-1含量升高之间的因果关系。

总之，本研究利用顺铂等化学药物造成了大鼠肾小管上皮细胞变性、坏死等急性病变，并且从分子水平和蛋白水平检测到肾Kim-1高表达，证明了由顺铂等化学药物诱导的大鼠AKI与肾Kim-1高表达之间的存在直接相关性，并解释了肾损伤模型中尿Kim-1含量增高的原因，为将尿Kim-1作为早期预测肾小管损伤的无创性生物指标提供了一定参考。

Figure 1 Histopathological examination of renal tissues(HE staining)图1 肾组织病理学检查（HE染色）

Figure 2 Product of GAPDH RT-PCR and negative control of 2%agarose gel electrophoresis图2 GAPDH RT-PCR产物和阴性对照2%琼脂糖凝胶电泳

Figure 3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of Kim-1图3 Kim-1 RT-PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳

Figure 4 Amplification and melting curves of Kim-1 and GAPDH图4 Kim-1和GAPDH的扩增曲线和熔解曲线

[1]Lassnigg A,Schmidlin D,Mouhieddine M,et al.Minimal changes of serum creatinine predict prognosis in patients after cardiothoracic surgery:a prospective cohort study[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(6):1597-1605.

[2]唐华，邹平，李著华.肾损伤分子-1研究进展[J].国际检验医学杂志，2006，27（8）：719-720,723.

[3]Tse C,Capeau J.Real time PCR methodology for quantification of nucleic acids[J].Ann Biol Clin(Paris),2003,61(3):279-293.

[4]Van MT,Bakker SJ,Vaidya VS,et al.Tubular kidney injury molecule-1 in protein-overload nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol,2006,291(2):456-464.

[5]De MB,Van MT,Vaidya VS,et al.Induction of kidney injury molecule-1 in homozygous Ren2 rats is attenuated by blockade of the renin-angiotensin system or p38 map kinase[J].Am J Physiol Renal Physiol,2007,292(1):313-320.

[6]Ichimura T,Asseldonk EJ,Humphreys BD,et al.Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells[J].J Clin Invest,2008,118(5):1657-1668.

[7]Kobayashi N,Karisola P,Peña-cruz V,et al.TIM-1 and TIM-4 glycoproteins bind phosphatidylserine and mediate uptake of apoptotic cells[J].Immunity,2007,27(6):927-940.

[8]Vaidya VS,Ramirez V,Ichimura T,et al.Urinary kidney injury molecule-1:a sensitive quantitative biomarker for early detection of kidney tubular injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,2006,290(2):517-529.

[9]吴昱，李晓玫.急性肾损伤相关生物标志物的研究进展[J].中国病理生理杂志，2010，26（8）：1650-1653,1661.

[10]Antoine DJ,Srivastava A,Munir P,et al.Statins inhibit aminoglycoside accumulation and cytotoxicity to renal proximal tubule cells[J].Biochem Pharmacol,2010,79(4):647-654.

[11]Pérez-Rojas JM,Derive S,Blanco JA,et al.Renocortical mRNA expression of vasoactive factors during spironolactone protective effect in chronic cyclosporine nephrotoxicity[J].Am J Physiol Renal Physiol,2005,289(5):1020-1030.

[12]Bailly V,Zhang ZW,Meier W,et al.Shedding of kidney injury molecule-1,a putative adhesion protein involved in renal regeneration[J].J Biol Chem,2002,277(42):39739-39748.