琥珀酰化对水酶法提取大豆蛋白的影响

刘 雯 江连洲，2 李 杨，2 黄 莉

琥珀酰化对水酶法提取大豆蛋白的影响

刘 雯1江连洲1，2李 杨1，2黄 莉1

(东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030)
(国家大豆工程技术研究中心2，哈尔滨 150030)

大豆蛋白是大豆水酶法的主要副产物，提高大豆蛋白提取率对于更好地实现大豆水酶法副产物的综合利用意义重大。通过将琥珀酰化与水酶法相结合，研究了加酶量、液料比、琥珀酸酐添加量、酶解时间和改性时间对总蛋白提取率的影响，并利用响应面分析法优化出最佳改性工艺参数:加酶量为2．24%，液料比为5．25∶1，琥珀酸酐添加量为5．13%，酶解时间为3．21 h，改性时间为1．64 h。在此条件下的总蛋白提取率为93．01%，多肽提取率为66．02%，与改性前相比分别提高了4．37% 和23．46%。

琥珀酰化 改性 大豆蛋白 水酶法

传统的植物油制取方法虽然能提取95%以上的油脂，但是提油后油料蛋白会严重变性，很难再作为食品或饲料再使用［1］。水酶法是一种新型的非有机溶剂提油技术，受到国内外油脂从业者和研究机构的广泛关注。它显著的优势是作用条件温和，能耗低，能避免有机溶剂的使用，是“绿色”提油工艺，能同时回收油料中的蛋白质、可溶性糖类、功能性因子等物质［2］。水酶法回收的蛋白含有部分大豆多肽。研究发现大豆多肽具有多种生理功能，例如，大豆多肽比大豆蛋白更易被消化吸收，抗原性更低，具有促进体内脂肪代谢，肌红细胞的复原，降低胆固醇，抑制血压升高，增强免疫力和抗自由基损伤(延缓衰老)等功能［3］。

琥珀酰化是蛋白质化学改性的常用方法，是通过大豆蛋白质分子的亲核基团(如氨基、羟基)与琥珀酸酐的亲电子基团(如羰基)相互反应，再引入琥珀酸亲水基团，在催化剂的作用下继续引入长碳链亲油基团，使大豆蛋白成为具有双极性基团的高分子表面活性剂［4］。研究结果表明琥珀酰化能够明显改善蛋白的功能特性，高度酰化的蛋白质在碱性条件下溶解度会增大，利用琥珀酰化后的蛋白进行酶解能够显著地提高多肽提取率［5－11］。

本试验将琥珀酰化与大豆水酶法相结合，研究了加酶量、液料比、琥珀酸酐添加量、酶解时间和改性时间对总蛋白提取率的影响，并利用响应面分析优化出最佳改性工艺参数，为提高大豆蛋白提取率，更好地实现大豆水酶法副产物的综合利用，以及开发出功能性更强的副产物产品提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

琥珀酸酐:国药集团化学试剂有限公司;Protex－6L碱性蛋白酶:美国杰能科酶制剂公司;大豆:黑龙江农业科学院培植的垦农47;其他试剂为分析纯。

1．2 试验仪器

PHS－25型数显酸度计:杭州奥立龙仪器有限公司;FA2004型电子天平:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;XMTD－4000型电热恒温水浴锅:北京市永光明医疗仪器厂;SC－3614型低速离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司;JJ－1精密增力电动搅拌机:金坛市双捷实验仪器厂;HYP－1 020二十孔消化炉、KDN－04Ш型蛋白质测定仪:上海纤检仪器有限公司;剖分式双螺杆挤压机(干法):东北农业大学工程学院农产品加工实验室自制。

1．3 试验方法

1．3．1 常规测定

粗蛋白的测定:依据GB 5009．5—2010。

水分的测定:依据 GB/T 14489．1—2008。

1．3．2 工艺流程:

大豆→膨化→粉碎(过40目筛)→预热(85℃10 min)→酶解(pH 9．5，50℃)→琥珀酰化→灭酶(100 ℃，10 min)→离心分离(4 500 r/min，20 min)→残渣→水洗→离心分离(4 500 r/min，20 min)→残渣

1．3．3 挤压膨化工艺参数［12］

模孔孔径20 mm，物料含水率14．5%，螺杆转速105 r/min，套筒温度90℃。

1．3．4 琥珀酰化改性方法

搅拌条件下在酶解液中分多次加入琥珀酸酐。反应过程中以1 mol/L NaOH调节溶液pH在8．0～8．5范围，直至反应结束。

1．3．5 多肽得率的测定

取酶解上清液，加入等量的10%的三氯乙酸(TCA)溶液，混合振荡30 min，然后离心分离20 min(4 000 r/min)，测得上清液可溶性氮。计算公式［三氯乙酸(TCA)可溶性氮法(NSI)］:

式中:N1为在10%TCA中可溶性氮/mg;N2为原料大豆中总氮/mg。

式中:m1为大豆含总蛋白质量/g，m2为酶解提取后残渣含蛋白质量/g。

1．4 试验设计

1．4．1 单因素试验

1．4．1．1 加酶量对水酶法总蛋白提取率的影响

琥珀酸酐添加量为物料的4%，液料比为6∶1，酶解时间为3 h，改性时间为2 h，加酶量分别取物料的1%、1．5%、2%、2．5%、3%，考察反应后总蛋白的提取率。

1．4．1．2 液料比对水酶法总蛋白提取率的影响

琥珀酸酐添加量为物料的4%，酶解时间为3 h，改性时间为 2 h，加酶量 2%，液料比分别为 4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1，考察反应后总蛋白的提取率。

大茉莉 上轿的时候母亲告诫我，想让男人记住家，就奉上茉莉花茶，让他记住家的味道，想要留住男人的心，就要像……

1．4．1．3 琥珀酸酐添加量对水酶法总蛋白提取率的影响

酶解时间为3 h，改性时间为1 h，加酶量2%，液料比为6∶1，琥珀酸酐添加量分别为物料的2%、3%、4%、5%、6%，考察反应后总蛋白的提取率。

1．4．1．4 酶解时间对水酶法总蛋白提取率的影响

加酶量2%，液料比为6∶1，琥珀酸酐添加量为4%，改性时间为 2 h，酶解时间分别取 1、2、3、4、5 h，考察反应后总蛋白的提取率。

1．4．1．5 改性时间对水酶法总蛋白提取率的影响

加酶量2%，液料比为6∶1，琥珀酸酐添加量为4%，酶解时间为 3 h，改性时间分别取 1、2、3、4、5 h，考察反应后总蛋白的提取率。

1．4．2 响应面设计

在单因素研究的基础上，选取加酶量、液料比、琥珀酸酐添加量、酶解时间、改性时间5个因素为自变量，以总蛋白提取率为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析试验(表1)。对试验结果数据采用 Design－Expert 7．0．1软件进行分析。

表1 响应面试验因素水平表

2 结果与分析

2．1 单因素试验分析

2．1．1 加酶量对大豆水酶法总蛋白提取率的影响从图1可以看出，当质量分数小于2%时，随着加酶量的增加，总蛋白提取率显著增加，当质量分数大于2%时，总蛋白提取率基本不变。为了在实际生产中节约成本，加酶量最优值初步定为2%。

2．1．2 液料比对大豆水酶法总蛋白提取率的影响

由图2可知，当液料比小于6∶1时，总蛋白提取率呈上升趋势，当液料比大于6∶1时，呈下降趋势。原因可能是，酶解时液料比小于6∶1有利于底物扩散，有利于酶与底物作用，但是水分过多降低则会底物和酶的浓度，不利于酶与底物作用。因此初步确定液料比为6∶1。

图2 液料比对总蛋白提取率的影响

2．1．3 琥珀酸酐添加量对大豆水酶法总蛋白提取率的影响

由图3可知，当添加量小于4%时，随着琥珀酸酐的添加，总蛋白提取率也不断增加，当添加量大于4%时，总蛋白提取率反而降低。其原因可能是添加琥珀酸酐对蛋白质进行改性，增加了蛋白质的溶解度，有利于蛋白酶解，破坏脂蛋白的结构，使油游离出来，但是添加过多，使改性蛋白的乳化性提高，反而不利于蛋白的提取。所以琥珀酸酐添加量定为4%。

图3 琥珀酸酐添加量对总蛋白提取率的影响

2．1．4 酶解时间对大豆水酶法总蛋白提取率的影响

从图4可以看出，酶解时间越长，总蛋白提取率越高，3 h内上升较快，3 h后上升较慢。考虑到能耗、生产周期及防止水解液变质等问题，确定最优酶解时间范围为2．5 ～4．5 h。

图4 酶解时间对总蛋白提取率的影响

2．1．5 改性时间对水酶法总蛋白提取率的影响

由图5可知，改性时间前3 h，总蛋白提取率缓慢增长，但是改性时间越长，总蛋白提取率反而降低。原因可能是改性时间越长，蛋白结构不断发生变化，乳化性增强，阻碍了酶的作用。所以改性时间范围定为1．5 ～2．5 h。

图5 改性时间对总蛋白提取率的影响

2．2 响应面分析

响应面设计方案和试验结果见表2，利用Design－Expert 7．0．1软件对试验结果进行二次回归分析，计算总蛋白提取率Y的回归方程并进行方差分析(表3)。总蛋白提取率Y的标准回归方程为:

表2 响应面设计方案和试验结果

表3 总蛋白提取率的试验结果方差分析表

由表2和表3的结果可以看出，所得回归方程极显著，且失拟检验不显著，这说明用回归方程Y拟合5个因素与总蛋白提取率之间的关系是可行的。回归方程Y的二次项 A2、D2以及交互项中的BC对总蛋白提取率有显著的影响，其他因素影响不显著，这表明响应值的变化相当复杂，各个试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二次关系，且5因素之间存在交互作用。对回归方程进行中心标准化处理，回归方程Y一次项回归系数的绝对值大小依次为B、E、D、A、C，表明5个因素对总蛋白提取率的影响顺序均为液料比＞改性时间＞酶解时间＞加酶量＞琥珀酸酐添加量。

图7是总蛋白提取率的三维曲面。由图7可知，改性时间、酶解时间、液料比、加酶量、改性物质添加量5个因素的交互作用对总蛋白提取率的影响，应用响应面优化分析方法对回归模型进行分析，可知当加酶量为2．24%，液料比为5．25∶1，琥珀酸酐添加量为5．13%，酶解时间为 3．21 h，改性时间为1．64 h，响应面有最优值，总蛋白提取率为(93．81±0．95)%。

2．3 验证试验和对比试验

采用上述优化后的工艺条件，即加酶量为2．24%，液料比为 5．25∶1，琥珀酸酐添加量为5．13%，酶解时间为3．21 h，改性时间为1．64 h，进行验证试验，测得总蛋白提取率为93．01%，多肽提取率为66．02%，结果与理论预测值误差在1%以内。这说明采用响应面法优化得到的工艺条件参数准确可靠，按照建立的模型进行预测在实践中是可行的。与改性工艺条件相比，即加酶量为2．24%，液料比为5．25∶1，酶解时间为 3．21 h，测得的总蛋白提取率为88．64%，多肽提取率为42．56%。

3 结论

3．1 影响总蛋白提取率的因素顺序为液料比＞改性时间＞酶解时间＞加酶量＞琥珀酸酐添加量。

3．2 利用响应面分析优化出的工艺参数为:加酶量2．24%，液料比 5．25∶1，琥珀酸酐添加量 5．13%，酶解时间3．2 h，改性时间1．64 h。在该条件下的总蛋白提取率为93．01%，多肽提取率为66．02%，与理论预测值误差在1%以内，这说明利用本试验建立的模型的优化结果与实际情况吻合。与改性前相比，总蛋白提取率和多肽提取率分别提高了4．37%和23．46%。

［1］李杨，江连洲，吴海波，等．挤压膨化工艺参数对水酶法提取大豆总蛋白得率的影响［J］．中国粮油学报，2009，24(12):47－51

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［12］李杨．水酶法制取大豆油和蛋白关键技术［D］．哈尔滨:东北农业大学，2010．

Effect of Succinylation on Aqueous Enzymatic Extraction of Soybean Protein

Liu Wen1Jiang Lianzhou1，2Li Yang1，2Huang Li1
(Food Science College，Northeast Agriculture University1，Harbin 150030)
(National Soybean Engineering Tech－nology Research Center2，Harbin 150030)

Soybean protein is the main by－product of the soybean aqueous enzymatic extraction．To improve the extraction rate of Soybean protein is significant for better integrated utilization of the by－product of the soybean anzyme－assisted aqueous extraction．This experiment combined succinylation with aqueous enzymatic extraction to study the relation between the extraction rate of total protein with the amount of the enzyme，liquid to material ratio，additive amount of succinic anhydride，hydrolysis time and modification time．Response surface analysis method was used to optimize experimental parameters，of which，enzyme additive amount was 2．24%，liquid to material ratio was 5．25∶1，additive amount of succinic anhydride was 5．13%，hydrolysis time was 3．21 h and modification time was 1．64 h．Under the conditions of the above parameters，the total protein extraction rate was 93．01%and the peptide extraction rate was 66．02%，which had improved separately 4．37%and 23．46%than those before modification．

succinylation，modification，soybean protein，aqueous enzymatic extraction

TS224．8

A

1003－0174(2012)02－0014－06

黑龙江省攻关项目(GA09B401－6)

2011－05－16

刘雯，女，1987年出生，硕士，粮食、油脂及植物蛋白

江连洲，男，1960年出生，教授，博士生导师，粮食、油脂及植物蛋白工程