车前子中黄酮提取物对油脂的抗氧化活性研究

张俊生 陈莉华 段琛圭 侯孝璇 何 莉

车前子中黄酮提取物对油脂的抗氧化活性研究

张俊生 陈莉华 段琛圭 侯孝璇 何 莉

﹙吉首大学化学化工学院，吉首 416000﹚

以车前子为原料超声强化乙醇提取黄酮，通过单因素和正交试验获得最佳工艺条件，研究了黄酮提取物对油脂的抗氧化性能及对羟基自由基的清除能力并与常用的抗氧化剂VC和柠檬酸比较。结果表明，在30%乙醇、料液比1∶40、超声温度60℃、超声强化处理60 min的最佳工艺条件时，车前子中黄酮的提取率为2．8%，该提取物对羟基自由基的清除作用随浓度增大而增强，对油脂有较强的抗氧化活性，抗氧化能力接近VC与柠檬酸，当油脂在烘箱放置时间延长使氧化程度加深时，黄酮对动物油的保护作用愈加显著，所以车前子黄酮提取物更宜于作为动物油的天然抗氧化剂添加于油脂及含油食品中。

车前子 黄酮 油脂 抗氧化活性

车前子(Semen Plantaginis)为车前科植物车前(Plantagoasiatica L．)或平车前(P．depressa Willd)的干燥成熟种子，是我国传统中医用药之一［1］。车前子性甘、微寒，归肝、肾、肺、小经。现代研究证明车前子具有致泻、护肝、降压、抑菌、降低血清胆固醇等多项药理作用［2］。

车前属植物中含有芹菜素、槲皮素及野芩黄素及其苷等多种黄酮类化合物，是车前属植物的主要有效成分之一［3－4］。黄酮类化合物除具有通常的抗菌、清热解毒、抑制脂肪氧化酶等生物活性外，在油脂抗氧化方面有显著效果，由于人工合成的抗氧化剂对人体有副作用，从植物中提取安全、天然的黄酮类物质以取代人工合成抗氧化剂是油脂或含油食品添加剂的发展趋势［5－6］。此前虽有关于大粒车前子黄酮类物质提取分离［7－8］及对总黄酮的抗氧化性研究［9］的报道，但相比于其他黄酮类成分的研究，车前子中黄酮功能成分的提取分离及相关研究亟待加强。本试验对车前子总黄酮提取物的体外抗氧化活性进行了研究，以期为开发中药天然抗氧化剂提供试验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

车前子:吉首市武陵山大药房，干燥粉碎，备用;芦丁对照品:中国药品生物制品鉴定所;动物油:市售新鲜猪板油;植物油:金健牌茶籽油，市售;无水乙醇、丙酮、氯仿、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、水杨酸、FeSO4、30%H2O2、柠檬酸、VC、冰醋酸:均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

JH 723可见分光光度计:上海菁华科技仪器有限公司;UV－2450紫外可见分光光度计:日本岛津;Gzx－9070MBE数显鼓风干燥箱:江苏新亿阳烘箱制造厂。

1．2 方法

1．2．1 芦丁标准曲线

以芦丁作为车前子黄酮提取物的对照品，按照NaNO2－Al(NO3)3－ NaOH 分光光度法［7］绘制芦丁标准曲线，在波长510 nm处测定吸光度A，以质量浓度c(mg/mL)对吸光度(A)进行线性回归得回归方程为:A=10．65c，R2=0．999 8。质量浓度在0 ～0．05 mg/mL之间有良好的线性关系。

1．2．2 车前子中黄酮类化合物的提取和测定

精确称取车前子粉末0．200 0 g于锥形瓶中，在不同的条件下进行超声波提取，提取液经离心过滤后，用相同体积分数的乙醇溶液定容至15 mL。准确吸取2．0 mL提取液，按照1．2．1中方法依次加入各种试剂，再加水定容至25 mL，以空白作参比，在最大吸收峰波长510 nm下测定吸光度A，由回归曲线方程求出浓度，并计算提取液中黄酮的质量。按照下列公式计算黄酮的提取率:

1．2．3 车前子黄酮提取物对羟基自由基的清除作用

参照Fenton反应［10］建立羟基自由基生成模型，在15 mL比色管中依次加入2 mmol/L FeSO43 mL，6 mmol/L H2O23 mL，摇匀，接着加入8 mL浓度为6 mmol/L的水杨酸溶液。加入1 mL的蒸馏水，没加粗提取物比色管所测的吸光度为，其余比色管根据试验条件加入不同浓度的提取物1 mL，在40℃水浴中放置15 min后取出，以蒸馏水为参比，于波长510 nm处测吸光度。

式中:Ax为加入提取液后的吸光度，A0为空白对照的吸光度。

1．2．4 过氧化值的测定

在无水酸性条件下，油脂中的过氧化物使I－定量氧化成I2，I2与I－结合生成易溶于水的I－3，利用的颜色与标准碘液进行比较定量。

按照文献［11］的处理方法，在353 nm波长下，I2含量(m/μg)对吸光度(A)的线性回归方程为:A=0．004 35m －0．249 96，R2=0．987 5。

车前子黄酮对油脂的抗氧化性采用国际通用的烘箱强化贮存法:用适量浓度的黄酮提取液(用VC和柠檬酸为对照)加到温热猪油与植物油中，搅匀，在一定温度的烘箱中强化保存，以不加任何抗氧化剂作对照组，于不同时间取样测定油样过氧化值。

在100 mL三角瓶中加入油∶黄酮溶液=5∶1(体积比)的油液溶液24 mL。在一定条件下反应，间隔70 min精密称取定量的油样于干燥的25 mL比色管中，加入氯仿－冰醋酸溶液5 mL，混匀，加入碘化钾饱和碱液0．2 mL，混匀，轻摇30 s，再置暗处3 min，然后加蒸馏水至刻度，加塞，颠倒混匀2～3次，静置约5～10 min，待水相澄清后，取上清液于1 cm石英比色皿中，在353 nm处以空白作参比读取各管的吸光值，由回归方程得碘含量。

抗氧化剂对油脂的保护率:

式中:η为抗氧化剂对油脂的保护率;POV初为未对油脂进行强化氧化时的过氧化值;POV末1为添加抗氧化剂的油脂强化氧化后的过氧化值;POV末2为未添加抗氧化剂的油脂强化氧化后的过氧化值。

2 结果与讨论

2．1 单因素试验

以车前子总黄酮的提取率为指标，在40 W超声功率、13 kHz超声频率及250 W加热功率的条件下，考察不同的乙醇体积分数、料液比、超声时间、温度等因素对提取率的影响。

2．1．1 乙醇体积分数对提取率的影响

在温度为30℃、料液比为1∶30、超声60 min时，考察不同体积分数的乙醇溶液对车前子黄酮提取率的影响，结果如图1所示。

图1 乙醇体积分数对提取率的影响

由图2可看出，乙醇体积分数增大黄酮的提取率随之增大，在乙醇体积分数为40%时达到最大，此后提取率下降。因此，后续试验选用40%乙醇作提取溶剂。

2．1．2 超声时间对提取率的影响

以40%的乙醇为提取剂，控制温度为30℃，料液比为 1∶30，分别超声 10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，结果如图2所示。

图2 超声时间对提取率的影响

由图2可看出，随着超声时间延长，车前子黄酮提取率40 min以前快速上升，40～50 min保持缓慢上升趋势，50～70 min又增长迅速，80 min后开始下降。有效成分浓度差是超声提取的主要动力，在提取初期，有效成分浓度差大，因此提取速率快，提取率也增加明显，随着提取时间的延长，溶剂中有效成分浓度逐渐增大，与固相中的浓度差逐渐变小，即推动力变小，所以提取速率慢慢减慢，提取率增加不明显，直至推动力为零，有效成分不再溶解［8］。随着时间的进一步延长，超声过程不断产热，对黄酮类化合物活性成分造成损失，从节约能源角度考虑，确定最佳工艺条件70 min为宜。

2．1．3 料液比对提取率的影响

以40%乙醇作溶剂，在温度为 30℃、超声70 min时，选择不同的料液比进行试验，结果如图3所示。

图3 料液比对提取率的影响

由图3可以看出，随着料液比的增加，黄酮提取率先增大，当增大到1∶40时到达最大，随后开始减小。因此选用1∶40的料液比进行提取。

2．1．4 温度对提取率的影响

以40%乙醇为溶剂，料液比为1∶40，在不同的温度下超声70 min，得到结果如图4所示。

图4 温度对提取率的影响

由图4可得，随着试验范围内温度的升高，黄酮提取率总体呈上升趋势。一般说来，温度升高，溶剂的表面张力系数及黏滞系数下降，蒸气压升高，超声空化阈值下降，有利于空化泡的产生，使提取率增大，但温度过高，容易导致活性物质失效。因此，选择60℃为宜。

2．2 正交试验确定最佳条件

综合前面所做的单因素试验，确定乙醇体积分数、超声时间、料液比、超声温度为主要影响因素，以黄酮提取率为判断指标，选用表1的L9(34)正交表进行试验，试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 L9(34)正交试验结果及数据分析

由表2中极差值R显示，超声提取各因素对车前子黄酮提取率影响的主次顺序为:A＞D＞B＞C，即超声温度影响最大，其次为料液比。由此可确定最佳工艺条件为 A3B2C1D3，即在60℃温度下，用30%乙醇以1∶40的料液比，超声60 min进行提取。

2．3 最佳工艺条件验证

采用正交试验中最佳工艺条件进行验证试验:称取车前子粉末1．00 g，加入40 mL 30%乙醇，在60℃下超声60 min，离心过滤，测定吸光度计算提取率，做 3次平行试验，提取率分别为:2．782%、2．828%、2．843%。结果显示，该工艺条件对结果有很好的稳定性。与文献［9］的工艺条件及得率(乙醇体积分数60%、固液比1∶30、90℃提取3次、每次2 h，总黄酮得率2．61%)比较，本试验由于采用了超声波辅助提取，溶剂耗用量减少，时间缩短，整体条件温和且得率提高。

2．4 车前子黄酮抗氧化性研究

2．4．1 车前子黄酮对羟自由基的清除作用

在40℃下，用不同浓度的黄酮提取液清除羟自由基，结果见图5。

图5 黄酮浓度对羟自由基清除率的影响

由图5可见，车前子提取物总黄酮在低浓度时对羟自由基的清除作用不明显，清除率仅为8% ～9%，而当黄酮质量浓度达到0．2 mg/mL以后，清除率可达到12．5%以上，表明总黄酮提取物对羟自由基有清除作用。

2．4．2 车前子黄酮对油脂的抗氧化性

VC和柠檬酸常作为加入到食品中的抗氧化剂，试验以此为对照，在40℃条件下，比较了0．50 mg/mL车前子黄酮、0．50 mg/mL VC、0．50 mg/mL 柠檬酸溶液在不同时间段对植物油(图6)及动物油(图7)的抗氧化性。

图6 不同抗氧化剂对动物油抗氧化性的影响

由图6的结果表明，随着油脂在烘箱放置时间延长，空白动物油的过氧化值(POV)快速上升，表明油脂自氧化反应程度加大;添加黄酮提取液后，动物油的过氧化值均有不同程度的降低，这表明提取液能增加动物油的抗氧化能力;烘箱放置时间在200 min前，柠檬酸、VC、黄酮提取液的抗氧化能力并不显著，POV值降低不多，但当烘箱放置时间超过250 min后，柠檬酸、VC、黄酮提取液的抗氧化能力显著增强，空白动物油与添加抗氧化剂的溶液的的过氧化值差距明显拉大;而黄酮提取液与常用的抗氧化剂柠檬酸、VC的抗氧化性没有太大差别。

图7 不同抗氧化剂对植物油抗氧化性的影响

图8 不同温度下黄酮提取物对动物油的保护率

图7 的结果表明，随着在烘箱放置时间延长，空白植物油的过氧化值快速上升，表明油脂自氧化反应程度加大;添加黄酮提取液后，植物油的过氧化值均有不同程度的降低，这表明提取液能增加植物油的抗氧化能力;车前子黄酮、柠檬酸、VC均能使植物油的POV值降低，但其降低效果不及动物油，这是因为某些植物油中含有维生素E、酚类化合物等［12］，这些物质也具有抗氧化作用，所以难以形成像动物油那样明显的对比;虽然不同的抗氧化剂对植物油的抗氧化能力不同，但车前子黄酮、柠檬酸、VC 3种抗氧化剂对植物油的抗氧化能力均非常接近。

2．4．3 温度对黄酮提取物抗油脂氧化效果的影响

在相同温度下，在烘箱强化保存时间的长短将使油脂的过氧化值有相当大的区别，同样，在相同的强化保存时间段，烘箱设置温度的高低也对油脂过氧化值有影响。由此研究了在0．50 mg/mL车前子黄酮、0．50 mg/mL VC、0．50 mg/mL柠檬酸溶液条件下，温度对黄酮抗油脂氧化效果的影响，结果如图8、图9。

由图8可知，在烘箱温度为40、50、和60℃时，黄酮提取物对动物油的保护率都呈先抑后扬趋势，随样品在烘箱放置时间的延长，黄酮对动物油的保护作用愈加显著，当放置时间为300 min时，黄酮提取物对动物油的保护率可达到50%以上，表明了黄酮提取物优越的抗氧化性能。在试验范围内，同一时间段，车前子黄酮提取物对动物油的保护率随温度的升高而降低，可能是因为黄酮类物质的活性随着温度的升高，而逐渐降低。

图9 不同温度下黄酮提取物对植物油的保护率

由图9可知，与对动物油的保护情况不同，随着温度的上升，黄酮提取物对植物油的保护率逐渐降低，说明车前子黄酮提取物更宜于作为动物油的抗氧化剂，在温和的环境中，升温会降低其活性。在40℃和50℃时，黄酮对植物油的保护率变化趋势大体相同，随着时间的延长，保护率逐步降低。

3 结论

试验表明，车前子在60℃下，选择30%乙醇为提取剂，料液比为 1∶40(g∶mL)，超声 60 min，提取率达到2．8%。该提取物对羟基自由基的清除作用随浓度增大而增强，对油脂有较强的抗氧化活性，抗氧化能力接近VC与柠檬酸，作为天然抗氧化剂可取代后者添加于油脂及含油食品中。

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Study on Grease Antioxidation of Flavone from Semen Plantaginis

Zhang Junsheng Chen Lihua Duan Chengui Hou Xiaoxuan He Li
(College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou 416000)

Flavone was extracted by ultrasonic－assisted ethanol from semen plantaginis．The influence factors were studied based on single factor and orthogonal test．The research on flavone＇s scavenging effect to hydroxyl free radical(·OH)and antioxidation to oil and fat of was carried out，and the result was compared with that of the other antioxidants such as VC and citric acid．The results showed that the extraction rate of flavone from semen plantaginis was 2．8%when the optimal technological conditions was 30%of ethanol，1∶40(g∶mL)of material－ to － liquid ratio and 60 min ultrasonic extracting time at 60℃ ultrasonic temperature．The scavenging capability on·OH free radical increased as flavone concentration increases．The flavone extract exhibited good antioxidant effects to fat and oil same as VC and citric acid．On condition that fat and oil were kept in oven for a longer time and consequently oxidation aggravation occurs，the antioxidative effect of the flavonoid extract on grease will become more apparent．So the flavonoid extract from semen plantaginis is more suitable to be a natural antioxidative additive for oil and grease．

semen plantaginis，flavone，fat and oil，antioxidation

S667．4

A

1003－0174(2012)02－0062－06

科技部科技型中小企业技术创新基金(10C262143 02421)，科技部科技型中小企业技术创新基金(11C26214305373)

2011－04－10

张俊生，女，1986年出生，硕士，应用化学

陈莉华，女，1961年出生，博士，教授，应用化学