六味参苓颗粒的质量标准研究

雷 宁，王 玲，孙健姿，吴 诚，刘丽宏

（解放军第二炮兵总医院药学部，北京100088）

六味参苓颗粒的质量标准研究

雷 宁＊，王 玲，孙健姿，吴 诚，刘丽宏#

（解放军第二炮兵总医院药学部，北京100088）

目的：建立六味参苓颗粒的质量控制方法。方法：采用薄层色谱（TLC）法对处方中西洋参、黄芪、麦冬、茯苓、枳壳进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定西洋参中人参皂苷Rb1的含量。结果：TLC专属性强，阴性对照无干扰；人参皂苷Rb1的浓度在26.4～792.0µg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系（r＝0.999 7），方法平均回收率为98.35%，RSD＝2.09%（n＝6）。结论：所建方法简便、可行，可用于六味参苓颗粒的质量控制。

六味参苓颗粒；薄层色谱法；高效液相色谱法；人参皂苷Rb1

六味参苓颗粒是以临床经验方为基础，经过现代制备工艺制成的中药复方制剂，由西洋参、黄芪、麦冬、茯苓、五味子、枳壳6味中药组成。临床用于治疗劳力过度、损伤心脾、耗伤气阴所致的脱力劳伤，症见倦怠乏力、肢体酸痛、足跟发软、手脚颤抖、头晕、困倦、烦躁不安、胸闷心悸、口干多汗，以及运动性疲劳见上述证候者。为有效控制其质量，确保临床用药安全、有效，笔者对处方中西洋参、黄芪、麦冬、茯苓、枳壳5味药材用薄层色谱（TLC）法进行定性鉴别，并用高效液相色谱（HPLC）法对西洋参中的药效成分人参皂苷Rb1进行了定量分析。以此建立的方法简便可行、重复性好，可用于六味参苓颗粒的质量控制。

1 仪器与试药

LC-20A HPLC仪，包括DGU-20A3脱气机、LC-20AT溶剂输送泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-20A紫外-可见检测器、LCSolution色谱工作站（日本岛津公司）；RE-52AA旋转蒸发器、SHZ-Ⅲ循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-500V超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司，功率：500 W，频率：40 kHz）；HWS28电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

六味参苓颗粒（批号：20090310、20090317、20090324，规格：4.5 g/袋）及相应阴性样品均由我院药学部制剂室自制；人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、黄芪甲苷对照品和麦冬、茯苓、枳壳对照药材（中国食品药品检定研究院，批号分别为 110704-200318、0754-9913、0703-200117、110781-200613、120955-200406、121117-100605、0981-200202）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；蒸馏水为我院自制双重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 定性鉴别

2.1 西洋参的TLC鉴别

取本品10 g，研细，加甲醇30 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，收集滤液，蒸干，残渣加水25 mL使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次10 mL，弃去乙醚液，水层用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次15 mL。合并正丁醇提取液，用水洗涤2次，每次20 mL，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；取缺西洋参的阴性样品适量，同法制成阴性对照溶液；另取人参皂苷Rb1、Re、Rg1对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg上述对照品的混合溶液，作为对照品溶液。照TL法[1]试验，吸取上述3种溶液各μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2 V/V/V）在10℃放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；阴性对照无干扰。西洋参的TLC见图1。C5， 。

图1 西洋参的TLC1.人参皂苷 Rb1、Re、Rg1混合对照品；2、3.供试品；4.阴性对照Fig 1 TLC of Panax quinguefolium1.mixed control of rinsenoside Rb1，Re，Rg1；2，3.test samples；4.negativecontrol

2.2 黄芪的TLC鉴别

取本品8 g，研细，加水饱和正丁醇80 mL，加热回流1 h，滤过，滤液用氨试液洗涤2次，每次40 mL，合并正丁醇液，再用水洗涤2次，每次40 mL，弃去水液，将正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；取缺黄芪的阴性样品，同法制成阴性对照溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）在10℃放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。黄芪的TLC见图2。

图2 黄芪的TLC1、2.供试品；3.黄芪甲苷对照品；4、5.阴性对照Fig 2 TLC of Astragali Radix1，2.test samples；3.astragaloside Ⅳ control；4，5.negative controls

2.3 麦冬的TLC鉴别

取本品10 g，研细，加水饱和的正丁醇30 mL，超声提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加盐酸2 mL，加热回流1 h，放冷，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷层，水浴蒸干溶剂，残渣加1 mL三氯甲烷使溶解，作为供试品溶液；取缺麦冬的阴性样品，同法制成阴性对照溶液；另取麦冬对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（2∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。麦冬的TLC见图3。

图3 麦冬的TLC1.缺麦冬阴性对照；2、3.供试品；4.麦冬对照药材Fig 3 TLC of Ophiopogon japonicus1.negative control without Radix Ophiopogonis；2，3.test sample；4.Ophiopogonis Radix reference substance

2.4 茯苓的TLC鉴别

取本品15 g，研细，加石油醚150 mL，超声处理30 min，滤过，药渣备用，滤液弃去，药渣挥干溶剂，加乙醚150 mL，超声处理10 min，滤过，药渣备用，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2 mL溶解，作为供试品溶液；取缺茯苓的阴性样品适量，同法制成阴性对照溶液；另取茯苓对照药材1.0 g，加甲醇20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加甲醇约1 mL溶解，作为对照药材溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G板上，以石油醚-丙酮-乙酸乙酯（84∶15∶1，V/V/V）饱和15 min后的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。茯苓的TLC见图4。

图4 茯苓的TLC1.茯苓对照药材；2、3.供试品；4.阴性对照Fig 4 TLC of Poria cocos1.Poria reference substance；2，3.test samples；4.negative control

2.5 枳壳的TLC鉴别

取本品10 g，研细，加甲醇30 mL，超声提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；取缺枳壳的阴性样品，同法制成阴性对照溶液；另取枳壳对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13，V/V/V）的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，紫外光（365 nm）灯下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。枳壳的TLC见图5。

3 人参皂苷Rb1的含量测定

图5 枳壳的TLC1.供试品；2.枳壳对照药材；3.阴性对照Fig 5 TLC of Crtras aurantium1.test sample；2.Aurantii Fructus reference substance；3.negativecontrol

3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Shimpack ODSC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱（0～20 min，25%～35%乙腈；20～30 min，35%～40%乙腈；30～35 min，40%乙腈）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：203 nm；柱温：35℃；进样量：10μL。在此色谱条件下，吸取供试品、对照品、阴性对照溶液适量，进样测定。结果，供试品中人参皂苷Rb1与其他组分峰能达到基线分离；阴性对照无干扰。理论板数按人参皂苷Rb1峰算应不低于2 500。色谱见图6。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液 精密称取人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每1 mL含5.28 mg的对照品贮备液。

3.2.2 供试品溶液 将适量本品研细，取约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液10 mL，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水15 mL使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次10 mL，弃去乙醚液，水层用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10 mL。合并正丁醇提取液，用水洗涤2次，每次10 mL，分取正丁醇液，置蒸发皿中，蒸干，残渣加50%甲醇适量使溶解，并转移至25 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图6 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.人参皂苷Rb1Fig 6 HPLCchromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.rinsenoside Rb1

3.2.3 阴性对照溶液 取缺西洋参的阴性样品适量，按“3.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

3.3 线性关系考察

分别精密吸取人参皂苷Rb1对照品贮备液0.05、0.10、0.20、0.50、0.80、1.00、1.20、1.50 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成不同浓度的对照品溶液，依次注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，人参皂苷Rb1检测浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝2 486X+15 753（r＝0.999 7，n＝6）。结果表明，人参皂苷Rb1检测浓度在26.4～792.0µg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

3.4 精密度试验

精密吸取浓度为0.528 mg·mL－1的人参皂苷Rb1对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下重复测定6次。结果，RSD＝1.57%（n＝6），表明仪器精密度良好。

3.5 加样回收率试验

称取已知人参皂苷Rb1含量的同一批号供试品（批号：20090324，含量：5.01 mg·g－1）约2.5 g，平行6份，精密称定，分别精密加入人参皂苷Rb1对照品溶液适量，按“3.2.2”项下方法处理，照上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

3.6 样品含量测定

分别取3批样品适量，按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，照上述色谱条件测定，以外标法计算人参皂苷Rb1的含量。结果，3批六味参苓颗粒（批号：20090310、20090317、20090324，规格：4.5 g/袋）中人参皂苷Rb1的含量分别为4.99、5.06、5.01 mg·g－1，平均含量为5.02 mg·g－1。

4 讨论

4.1 流动相的选择

制剂处方中的君药西洋参是名贵中药材，人参皂苷为其主要活性成分之一，常被用作西洋参制剂的定量标准成分。本文在考察流动相时，曾根据文献研究了甲醇-水[2]、乙腈-0.4%磷酸[3]等梯度洗脱的效果，结果均不能将人参皂苷Rb1的色谱峰与其他峰完全分离，且峰形不佳。最后选择乙腈-水梯度洗脱体系，结果能使样品中人参皂苷Rb1的色谱峰得到良好分离。

4.2 流动相梯度的优化

含量测定的难点主要在于将西洋参中人参皂苷Rb1与制剂中其他皂苷类成分完全分离。笔者在参考2010年版《中国药典》中西洋参含量测定方法以及文献[4，5]方法的基础上，对流动相的梯度进行了优化，从而实现了人参皂苷Rb1与麦冬、黄芪等药材中皂苷类成分的基线分离。

4.3 供试品溶液的制备方法

西洋参制剂组方有简有繁，成分复杂多样，六味参苓颗粒组方中西洋参、黄芪、麦冬药材均含有皂苷和多糖类成分。在供试品溶液的制备过程中，笔者先后考察了甲醇超声提取、甲醇回流提取再大孔树脂吸附等方法。结果均不理想，最后采取先用乙醚脱脂，后用正丁醇萃取富集皂苷，再用水洗涤正丁醇层去除糖类杂质的方法，在TLC鉴别和含量测定中均能较好运用。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录34.

[2] 黄海欣.ELSD-HPLC法测定生脉饮中人参皂苷Re、Rg1和Rb1的含量[J].中国药师，2010，13（7）：1 045.

[3] 邹文光，黄 晨.HPLC测定血塞通胶囊中四种皂苷含量的研究[J].中国现代药物应用，2010，4（10）：99.

[4] 冯 旭，邓家刚，李 松.复方黄根颗粒的质量标准研究[J].中国药房，2011，22（15）：1 402.

[5] 杨 军，马 静，李学林.不同厂家参脉注射液特征指纹图谱的比较[J].中国药房，2011，22（7）：633.

Study on Quality Standard of Liuwei Shenling Granules

LEI Ning，WANG Ling，SUN Jian-zi，WU Cheng，LIU Li-hong
（Dept.of Pharmacy，Second Artillery Forces General Hospital of PLA，Beijing 100088，China）

OBJECTIVE：To establish the quality control of Liuwei shenling granules.METHODS：Panax quinquefolium，Astragali Radix，Ophiopogon japonicus，Poria cocos and Citrus aurantium were identified by TLC.The content of ginsenoside Rb1in Panacis Quinquefolii Radix was determined by HPLC.RESULTS：The TLC identification method exhibited good specificities without interference form negative samples.The linear range of ginsenoside Rb1 was 26.4～792.0µg·mL－1（r＝0.999 7）and the average recovery was 98.35%（RSD＝2.09%，n＝6）.CONCLUSION：The established standard is simple，feasible and suitable for the quality control of Liuwei shenling granules.

Liuwei shenling granules；TLC；HPLC；Ginsenoside Rb1

R284.2；R283.627

A

1001-0408（2012）35-3328-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.23

2011-09-07

2011-11-20）