正交试验优选水飞蓟果仁磷脂提取工艺

杜向萍，陈钧，张春晓，郭丹钊，2，杨学娟，刘友彬（.江苏大学药学院，江苏镇江2203；2.河南科技学院生科院，河南新乡 453003）

正交试验优选水飞蓟果仁磷脂提取工艺

杜向萍1＊，陈钧1#，张春晓1，郭丹钊1，2，杨学娟1，刘友彬1（1.江苏大学药学院，江苏镇江212013；2.河南科技学院生科院，河南新乡 453003）

目的：优化水飞蓟果仁中磷脂的提取工艺。方法：在单因素试验基础上，选取正庚烷-乙醇比例、固液比、提取时间、提取温度为考察因素，以水飞蓟果仁中磷脂得率为评价指标，采用正交试验优选工艺。结果：最佳提取工艺为正庚烷-乙醇（3∶1，V/V），提取温度80℃，固液比1∶9（m/V），提取时间120min，在此条件下水飞蓟果仁中磷脂得率为0.3402%。结论：所选工艺合理、可行，可为水飞蓟药材资源的综合开发与应用提供依据。

水飞蓟果仁；磷脂；回流提取；钼蓝比色法

水飞蓟（Sliybum maruianum L.Gaertn.）又名水飞雉、乳雉子，是菊科水飞蓟属植物，原产于地中海沿岸[1]，是欧洲民间的一种草药。它的药用有效成分水飞蓟宾存在于其廋果水飞蓟籽的果皮中，果仁含油脂25%[2]。磷脂是生物膜的重要组成部分，具有重要的生物学活性，如健脑、抗疲劳、降血脂[3～6]等。植物磷脂与蛋白质、糖类、脂肪酸等物质以结合状态存在，是一类重要的油脂伴随物[7]。目前，关于水飞蓟果仁中磷脂的相关研究未见报道。因此，本试验旨在通过单因素和正交试验确定水飞蓟果仁中磷脂的最佳提取工艺，为水飞蓟籽的综合利用提供研究基础。

1 仪器与试药

SARTORIUS AG电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；BuchiR-200旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；KQ-600DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；H-S数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）；UV-2500紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

水飞蓟籽药材，购于江苏中兴药业有限公司，经江苏大学药学院陈钧教授鉴定为菊科植物水飞蓟的果实，经脱壳机进行壳仁分离后，收集水飞蓟果仁于干燥箱中，60℃干燥，粉碎过筛，置干燥器中，备用。硝酸、高氯酸均为优级纯，正庚烷、正己烷、异丙醇、无水乙醇、无水硫酸钠、抗坏血酸、钼酸铵、磷酸二氢钾、98%浓硫酸等均为分析纯。显色液：3mol·L－1硫酸-水-2.5%钼酸铵-10%抗坏血酸（1∶5∶1∶1，V/V/V/V），配制时按顺序、比例加入，当天配制当天使用[8]。

2 方法与结果

2.1 总磷脂的含量测定

2.1.1 磷标准液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的磷酸二氢钾0.4392g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，为磷贮备液；精密吸取贮备液1mL，置于100mL量瓶中，用蒸馏水定容，作为磷标准液，此液含磷10.01μg·mL－1。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取水飞蓟果仁粉末10g，加正庚烷-乙醇（HPE，1∶1，V/V）50mL，70℃水浴回流提取1h，滤过，滤渣用20mL HPE（1∶1，V/V）混合溶剂冲洗，合并滤液，加入1/4总量的1%Na2SO4，混匀，分液漏斗中静置后样品分为2相，下相用混合溶剂重复萃取2次，合并上相，经无水Na2SO4干燥后滤过，滤液于40℃旋转蒸发、浓缩，浓缩液定容至25mL[9]。

2.1.3 总磷脂含量的测定方法 采用紫外-可见分光光度法，通过钼蓝比色法测定总磷脂含量。精密吸取供试品溶液0.5mL，置于锥形瓶中，水浴上挥干溶剂，另取一只锥形瓶为空白，分别加入一定量的消化液（高氯酸∶硝酸＝1∶4，V/V）[9]。先在电炉上小火加热消化约30min，待黄烟冒尽后，升高温度加热至大量白烟冒尽并有白色固体析出，停止消化。消化完全后，分别用显色液定容至5mL，65℃水浴恒温10min，冷却后以空白调零，于指定波长处测定吸光度，根据回归方程计算供试品中磷的含量，将所得结果乘以磷脂转换系数25，即得总磷脂含量[10]。

2.1.4 最大吸收波长的确定 精密吸取供试品溶液0.5mL，置于锥形瓶中，水浴上挥干溶剂，另取锥形瓶2只，一只加入磷标准液0.2mL，一只作为空白管，各管分别加入一定量消化液，按“2.1.3”项下方法操作，在500～900nm波长范围内测定磷标准液和供试品溶液的吸光度，确定最大吸收波长。结果，二者均在830nm波长处有最大吸收，吸收光谱基本一致。Abraham SA等[11]指出该波长在820nm处，本文结果与文献报道一致，故确定最大检测波长为830nm。紫外吸收光谱见图1。

图1 紫外吸收光谱Fig 1 UV absorption spectrum

2.1.5 标准曲线的制备 精密量取磷标准液0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mL，分别置洁净干燥的锥形瓶中，各加入一定量的消化液，与供试品同步进行。按“2.1.3”项下方法操作，于830nm波长处测定吸光度。以吸光度（y）为纵坐标，磷检测浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝0.239x+0.0026（r＝0.9998）。结果表明，磷的检测浓度在0.2002～0.6006μg·mL－1范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.2 提取工艺优化

2.2.1 单因素试验 在其他条件都相同的情况下，分别依次考察提取溶剂种类（HPE、正庚烷-异丙醇（HPIP）、正己烷-乙醇（HXE）、正己烷-异丙醇（HXIP））、各组混合溶剂的配比（6∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，均为V/V）、提取时间（60、90、120、150、180min）、固液比（1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11，均为m/V）、提取温度（60、70、80、90、100℃）等对磷脂得率（得率＝磷脂质量/药材质量×100%）的影响。结果表明，当提取溶剂为HPE，溶剂配比为3∶1，提取时间为120min，固液比为1∶7，提取温度为90℃时，水飞蓟果仁磷脂得率最佳。

2.2.2 正交试验 根据单因素试验结果，精确称取10g水飞蓟果仁粉末数份，以HPE为提取溶剂，选择HPE比例（A，V/V）、固液比（B，m/V）、提取时间（C）、提取温度（D）为考察因素，按L9（34）正交设计表进行试验，每个试验重复3次，以水飞蓟果仁磷脂得率为评价指标优选工艺。因素水平见表1；正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验结果Tab 2Results of orthogonal test

由表2、表3可知，各因素对磷脂得率的影响主次顺序为A＞D＞B＞C，即HPE比例＞提取温度＞固液比＞提取时间，其中，HPE比例、提取温度对磷脂得率有显著性影响（P＜0.05）。最佳工艺为A3B2C2D3，即HPE比例3∶1（V/V），提取温度80℃，固液比1∶9，提取时间120min。

2.3 提取次数对水飞蓟果仁磷脂得率的影响

笔者在上述优化工艺条件下，考察了不同提取次数对水飞蓟果仁磷脂得率的影响。结果，提取1次的磷脂得率为0.3402%，提取2次的磷脂得率为0.3508%，提取3次的磷脂得率为0.3545%，表明随着提取次数的增加，磷脂得率呈上升趋势，但增量不明显。考虑到减少操作环节和节约成本等因素，提取次数选为1次较适宜。

2.4 工艺验证试验

取水飞蓟果仁粉末适量，在最佳提取工艺下进行3次重复试验。结果，磷脂得率分别为0.3369%、0.3427%、0.3408%，其平均值为0.3402%，与正交试验结果最高值相当，表明所选工艺合理、可行。

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

3 讨论

磷脂是细胞膜的组成成分，与蛋白和多糖形成复合物，较难提取。由Folch（1957）创建的氯仿-甲醇混合溶剂提取法至今仍是较流行的脂质提取方法，但氯仿、甲醇是高毒性和高刺激性的有机溶剂，故本文另选用安全性较高的烷烃-醇-水体系进行提取。

[1] 徐德峰，张卫明，史劲松，等.国内水飞蓟资源利用现状与展望[J].食品研究与开发，2007，28（2）：157.

[2] 陈毓荃，王春梅，张 文.水飞蓟综合利用基础研究Ⅱ果实油脂和蛋白质[J].西北农业学报，1998，7（1）：79.

[3] 王 芳，余恩欣，吴东方.银杏叶提取物磷脂酰胆碱复合物对缺血大鼠学习记忆障碍的影响[J].中国药学杂志，2004，39（2）：114.

[4] 刘淑娟.不同磷脂对小鼠耐力影响的比较研究[J].山东农业大学学报（自然科学版），2006，37（2）：208.

[5] 何新霞，胡燕月，金晓玲.大豆磷脂对大鼠实验性高脂血症的预防[J].浙江师大学报（自然科学版），2001，24（2）：191.

[6] 石富成，周景春，佟 铭，等.大豆磷脂治疗高脂血症的有效剂量及其主要成分[J].中国生化药物杂志，1998，19（3）：150.

[7] 曹 栋，裘爱泳，王兴国.磷脂结构、性质、功能及研究现状[J].粮食与油脂，2004，5：3.

[8] 王立新，吴启南，吴德康.钼蓝比色法测定不同产地合子草中总磷脂的含量[J].中国野生植物资源，2001，20（3）：50.

[9] 王维亚.乌骨鸡磷脂的提取、成分分析及活性研究[D].南昌：南昌大学，2007.

[10] 上海市医学化验所.临床生化检验（上册）[M].上海：上海科学技术出版社，1979：185-187.

[11] Abraham SA，Edwards K，Karlsson G，et al.An evaluation of transmembrane ion gradient-mediated encapsulation of topotecan within liposomes[J].J Control Release，2004，96（3）：449.

Optimization of Extraction Technology of Phospholipids from the Kernel of Sliybum maruianum

DU Xiang-ping，CHEN Jun，ZHANG Chun-xiao，GUO Dan-zhao，YANG Xue-juan，LIU You-bin（College of Pharmacy，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China）
GUO Dan-zhao（College of Life Science and Technology，Henan Institute of Science and Technology，Henan Xinxiang 453003，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of phospholipids from the kernel of Sliybum maruianum.METHODS：Based on single factor test，the extraction technology was optimized by orthogonal test with ratio of heptane to ethanol，the ratio of solid to liquid，extraction time，extraction temperature as factors using the yield of phospholipids as index.RESULTS：The optimal extraction condition was as follows：the ratio of heptane to ethanol of 3∶1（V/V）extraction temperature of 80℃，the ratio of solid to liquid of 1∶9（m/V），extraction time of 120min.The yield of phospholipids was 0.3402%under the optimal extraction condition.CONCLUSION：The optimal technology is reasonable and feasible，and it can provide theoretical base for the further development of S.maruianum.

Kernel of Sliybum maruianum；Phospholipids；Reflux extraction；Molybdenum blue method

R284.2；R283.2

A

1001-0408（2012）35-3305-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.14

2011-09-23

2011-11-26）