正交试验优选荭叶软胶囊中荭草和山楂叶的提取工艺Δ

张治蓉，黄 勇，郑 林，王爱民，王永林（贵阳医学院药学院，贵阳 550004）

正交试验优选荭叶软胶囊中荭草和山楂叶的提取工艺Δ

张治蓉＊，黄 勇#，郑 林，王爱民，王永林（贵阳医学院药学院，贵阳 550004）

目的：优选荭叶软胶囊中荭草、山楂叶的提取工艺。方法：分为水提取和醇沉淀2个步骤，均采用正交试验，以异荭草素+荭草素、金丝桃苷的转移率，总固体物得率的综合评分作为评价指标，以加水量、提取时间、煎煮次数为考察因素，优选水提取工艺；以异荭草素+荭草素、金丝桃苷转移率的综合评分为评价指标，以相对密度、醇沉浓度、放置时间为考察因素，优选醇沉工艺。结果：最佳水提工艺为8倍药材量的水煎煮3次，每次1h；最佳醇沉工艺为药液浓缩至相对密度为1.07，醇沉浓度为65%，放置12h。结论：该提取工艺合理、可行，可用于荭叶软胶囊中荭草、山楂叶的提取。

提取工艺；荭叶软胶囊；金丝桃苷；荭草素

荭叶软胶囊是由荭草、山楂叶等药材经现代制剂技术加工制成的中成药，具有活血化瘀、通脉止痛的功放，临床上用于治疗冠心病心绞痛、心血瘀阻证。为提高制剂有效成分含量，降低固形物量，笔者采用正交设计，对加水量、煎煮时间、煎煮次数、醇沉浓度等因素进行研究，优化荭草、山楂叶水提醇沉工艺。

1 仪器与试药

LC-10Avp高效液相色谱（HPLC）仪，包括LC-10ATvp输液泵、SPD-10Avp紫外检测器、7725i手动进样阀（日本岛津公司）；WML色谱工作站（广西威玛龙色谱科技公司）；TCQ-250超声波清洗器（北京医疗设备二厂）。金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111521-200303）；异荭草素和荭草素标准品（笔者自制，纯度均＞98.0%）；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 生药吸水量试验

按处方比例称取荭草37.5g、山楂叶30.0g若干份，加10倍量即675mL水，浸泡，于0.5、1.0、2.0、3.0h取出药材，滤出浸泡液并用量筒量出体积，根据吸水量计算药材的吸水率，至吸水率趋于平衡，此时的吸水量即为生药吸水量。结果，0.5、1.0、2.0、3.0h时，吸水量分别为105、152、191、196mL，吸水率分别为156%、225%、283%、290%，表明吸水率为300%左右时趋于平衡，故确定第1次提取时多加3倍量水。

2.2 荭草素和异荭草素含量测定[1]

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：DiamonsiL C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（15∶85，V/V）；检测波长：350nm；柱温：40℃；流速：1.0mL·min－1。理论板数按异荭草素、荭草素峰计分别为8000、8400。

2.2.2 标准品溶液的制备 精密称取异荭草素、荭草素标准品适量，置于100mL量瓶中，分别用甲醇溶解至刻度，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取水煎液、醇沉液适量，置于25mL量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取上述标准品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，检测浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得异荭草素、荭草素回归方程分别为Y＝22707X－2709（r＝0.9999）、Y＝21367X+5004（r＝0.9998）。结果表明，异荭草素、荭草素的检测浓度分别在8～128、7.5～120.0µg·mL－1范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3 金丝桃苷含量测定[2]

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Lichrospher C18（250mm×4.6mm，5µm）；保护柱：SecurityGuard C18（3mm×4mm）；流动相：乙腈-四氢呋喃-0.5%冰醋酸溶液（2∶15∶83，V/V/V）；检测波长：363nm；柱温：40℃；流速：1mL·min－1。理论板数按金丝桃苷峰计应不低于5000。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷对照品适量，置于50mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取水煎液、醇沉液适量，置于25mL量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。

城市综合枢纽不仅注重多种交通方式的组合，还重视周围区域城市空间的综合利用和开发，这就需要政府部门不断开发枢纽区域的土地，以提升土地的整体利用率，将商业、办公、居住和娱乐结合起来发展，形成为旅客提供全过程服务的中心。

2.3.4 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，检测浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得金丝桃苷的回归方程为Y＝16449X+3667（r＝0.9998）。结果表明，金丝桃苷检测浓度在5.5～88.0µg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4 总固体物的提取

精密吸取已测定总体积的续滤液25mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥至近干，于105℃干燥至恒重，称量，计算总固体物量。

2.5 水提取工艺优选

2.5.1 试验设计 根据文献资料及预试验结果，选取加水量（A）、提取时间（B）、煎煮次数（C）为考察因素，采用L9（34）正交表进行试验。提取工艺的因素水平见表1。

表1 提取工艺的因素水平Tab 1 Factors and levels of extraction technology

2.5.2 正交试验结果 取荭草75g、山楂叶60g，按表1的安排进行试验，照“2.2”和“2.3”项下方法测定异荭草素+荭草素、金丝桃苷含量，并分别计算转移率（转移率（%）＝供试品中指标成分的量/药材中指标成分的量×100%）和总固体物得率（总固体物得率（%）＝总固体物重量/药材样品总重量×100%）。对上述3个指标分别给予权重系数0.4、0.4、0.2，相加即得综合评分。提取工艺的正交试验结果见表2；提取工艺的方差分析结果见表3。

从表2、表3可知，各因素影响提取效率的顺序为C＞B＞A，其中煎煮次数和提取时间对工艺有显著性影响（P＜0.05），最佳工艺条件为A3B3C3。而A因素对工艺无显著性影响，从提高效率方面考虑，选择水平1；B因素虽对工艺有显著性影响，但其次佳水平与最佳水平的极差转小，从省时方面考虑，选择水平2，故选取工艺为A1B2C3。

2.5.3 水提工艺比较试验 为进一步证实该工艺的合理性，按“2.5.2”项下方法对工艺A3B3C3和A1B2C3进行比较试验。结果，异荭草素+荭草素转移率分别为81.30%、80.25%，金丝桃苷转移率分别为72.72%、70.20%，总固体物得率分别为23.94%、22.36%。2种工艺比较无明显差异，而工艺A1B2C3具有低耗能、省时特点，故选择此生产工艺，即加药材重量8倍的水（第1次多加3倍量），煎煮3次，每次1h，滤过，合并滤液，浓缩，备用。

2.5.4 水提工艺验证试验 取荭草375g、山楂叶300g，共取3份，按优选工艺A1B2C3分别进行提取，并计算异荭草素+荭草素、金丝桃苷转移率和总固体物得率。结果，异荭草素+荭草素平均转移率为80.96%，金丝桃苷平均转移率为71.13%，总固体物平均得率为22.15%，与正交试验结果最高值相当，表明所选工艺稳定、可行。

2.6 醇沉工艺的优选

2.6.1 试验设计 根据文献资料及预试验结果，选取药液的相对密度（A）、醇沉浓度（B）、放置时间（C）为考察因素，采用L9（34）正交表进行试验。醇沉工艺的因素水平见表4。

表2 提取工艺的正交试验结果Tab 2Results of orthogonal test of extraction technology

表3 提取工艺的方差分析结果Tab 3 Variance analysis of extraction technology

表4 醇沉工艺的因素水平Tab 4 Factors and levels of alcohol precipitation technology

2.6.2 正交试验结果 取“2.5.4”项下水煎液，混匀，测定异荭草素、荭草素、金丝桃苷含量，再取相当于荭草75g、山楂叶60g生药的水煎液9份，按表4安排进行试验。照“2.5.2”项下方法测定异荭草素+荭草素、金丝桃苷提取率，对上述指标分别给予权重系数0.5、0.5，相加即得综合评分，以综合评分为评价指标优选工艺。醇沉工艺的正交试验结果见表5；醇沉工艺的方差分析结果见表6。

表5 醇沉工艺的正交试验结果Tab 5 Results of orthogonal test of alcohol precipitation technology

表6 醇沉工艺的方差分析结果Tab 6Variance analysis of alcohol precipitation technology

从表5、表6可知，各因素影响醇沉效率的顺序为A＞B＞C，其中相对密度和醇沉浓度对工艺有显著性影响（P＜0.05），最佳工艺条件为A2B2C3。而C因素的最佳工艺和次佳工艺的极差较小，从省时方面考虑，选择次佳工艺A2B2C2。

2.6.3 醇沉工艺比较试验 为进一步证实该工艺的合理性，按“2.5.2”项下方法对工艺A2B2C3和A2B2C2进行比较试验。结果，异荭草素+荭草素转移率分别为81.78%、80.71%，金丝桃苷转移率分别为86.31%、86.74%。2种工艺比较无明显差异，而工艺A2B2C2具有低耗能、省时的特点，故选择此生产工艺，即煎煮液浓缩至相对密度为1.07（50℃）、加乙醇使含醇量为65%，搅拌，放置12h，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩，备用。

2.6.4 醇沉工艺验证试验 取荭草1500g、山楂叶1200g，按水煎煮工艺煎煮，合并滤液，均分为4份，1份照“2.5.2”项下方法测定异荭草素+荭草素、金丝桃苷提取率，总固体物得率。另3份按醇沉最佳工艺A2B2C2进行处理，同法测定异荭草素+荭草素、金丝桃苷提取率。结果，异荭草素+荭草素平均转移率为80.24%，金丝桃苷平均转移率为85.82%，总固体物得率为63.75%，与正交试验结果最高值相当，表明醇沉工艺稳定、可行。

3 讨论

提取工艺的评价指标应是提取有效成分质和量的代表，也是提取物临床作用性质和强度的代表，全面的工艺评价指标能够更客观、更真实的评价其提取工艺的优劣。方中荭草主要含异荭草素、荭草素、牡荆素等成分，具有抗急性心肌缺血、扩张血管等作用[3，4]；山楂叶中主要含有金丝桃苷、槲皮素等成分，具有降压、增加冠脉血流量、清除氧自由基等作用[5，6]。因此，在工艺研究中以异荭草素、荭草素和金丝桃苷的转移率为评价指标，对荭草和山楂叶的水提醇沉工艺进行探讨。工艺验证结果表明，荭草、山楂叶中黄酮类代表成分平均转移率均＞60%，其转移率较高，稳定性好，说明本提取工艺稳定、可行。

[1] 万先伦，马 琳，王永林，等.HPLC测定荭叶心通软胶囊中异荭草素、荭草素的含量[J].中国中药杂志，2007，32（16）：722.

[2] 刘丽娜，李勇军，何 迅，等.高效液相色谱法测定荭叶心通软胶囊中金丝桃苷含量[J].中国药业，2008，17（10）：25.

[3] 付晓春，王敏伟，李少鹏，等.荭草苷对缺氧-复氧心肌细胞的保护作用[J].沈阳药科大学学报，2005，22（1）：45.

[4] 谢周涛，何再安，刘众文.荭寥的化学成分及药理研究进展[J].时珍国医国药，2005，16（1）：1034.

[5] 李卓恒，孟德胜，卢来春，等.正交试验优选贯叶金丝桃中金丝桃苷的乙醇提取工艺[J].中国药房，2011，22（11）：992.

[6] 李庆林，俞桂新，陈志武，等.金丝桃苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药学杂志，2002，37（11）：829.

Optimization of Extraction Technology of Polygonum orientale and Crataegi Folium from Hongye Soft Capsule

ZHANG Zhi-rong，HUANG Yong，ZHENG Lin，WANG Ai-min，WANG Yong-lin（School of Pharmacy，Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Polygonum orientale and Grataegi Folium from Hongye soft capsule.METHODS：Extraction process included water extraction and alcohol precipitation，and orthogonal experiments were carried out.The water extraction technology was optimized with amount of added water，extraction time and decoction times as factors using transfer rate of isorientin，orientin，hyperoside and the yield of total solid as evaluation index；the alcohol precipitation technology was optimized with relative density，concentration of alcohol precipitation and setting time as factors using transfer of isorientin，orientin，hyperoside as index.RESULTS：The optimal water extraction condition was as follows：8-fold water，extracting for 3times，1hour for each time.The optimal alcohol precipitation condition was as follows：the relative density of 1.07，the concentration of alcohol precipitation 65%and storing for 12hours.CONCLUSION：The extraction technique is reasonable and feasible，which can be used for the extraction of P.orientable and Crataegi Folium from Hongye soft capsule.

Extraction technology；Hongye soft capsule；Hyperoside；Orientin

R284.2；R2883.621

A

1001-0408（2012）35-3297-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.11

Δ贵州省科技计划课题（黔科合重大专项字[2007]6010、黔科合计工字[2009]4001）

＊硕士研究生。研究方向：天然药物药动学与新药活性评价。电话：0851-6908899。E-mail：zzr616@126.com

#通讯作者：副教授。研究方向：中药活性物质基础，药动学，药物新剂型、新技术。E-mail：mailofhy@126.com

2011-11-17

2012-04-17）