舒郁宁心汤对抑郁大鼠海马Bcl-2和Bax表达的影响①

黄泉智，许成勇，孙志高，杨阳，胡亚卓，陈利平，王发渭

抑郁症是一种以持续情绪低落、兴趣或愉快感丧失为主要症状的情感障碍性疾病[1]。世界卫生组织预测，到2020年抑郁障碍将成为发展中国家最严重的疾病负担，人类死亡、残疾的第2大原因，女性死亡和残疾的首位疾病[2]。有研究显示，慢性应激增加海马神经元凋亡，引起海马结构和功能的变化，参与抑郁症的发病[3]。本实验通过观察抑郁模型大鼠海马区凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达的变化，探索舒郁宁心汤抗抑郁功效的可能机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠70只，体重(200±20)g，解放军总医院实验动物中心提供，许可证编号：SLXK京2009-0007。

1.1.2 药物 盐酸氟西汀分散片：PATHEON FRANCE公司(批号：9711B)，20 mg/粒，蒸馏水配成浓度为0.4 mg/ml的混悬液，现用现配。舒郁宁心汤由柴胡、郁金、栀子、茯神、酸枣仁组成，解放军总医院中药房鉴定提供，上药浸泡、煎煮、过滤，于80℃恒温水浴中浓缩至含生药量5 g/ml药液，4℃冰箱保存备用。

1.1.3 主要试剂及设备 Bcl-2多克隆抗体(批号：990785W)和Bax多克隆抗体(批号：909901W)：北京博奥森生物技术有限公司产品；二抗显色试剂盒：EnVision Detection Kit基因科技(上海)有限公司产品(Code No.GK500705)；全自动真空脱水机(LEICA ASP300)、组织包埋机(LEICA EG1140H)、石蜡切片机(LEICA RM2135)、展片机(LEICA HI1210)：德国LEICA公司；光学显微镜：日本OLYMPUS BX60系统显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型建立 动物饲喂于解放军总医院实验动物中心SPF级啮齿类动物实验室，温度20℃~24℃，噪声≤60 dB，昼夜节律12/12 h。大鼠自由摄食和饮水，适应性饲养7 d后行旷场(open-field)试验进行行为学评分，选择得分相近的60只随机分为6组：对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、盐酸氟西汀组，每组10只。造模方法采用孤养加慢性轻度不可预见性的应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型[4]并稍加改进：对照组每笼饲养5只，正常饮食、饮水，不予任何刺激；其余各组每笼饲养1只，并接受21 d慢性应激刺激，包括禁水24 h、禁食24 h、夹尾1 min、电击足底(20 V,1 s/次,间隔1 min,共20次)、冰水游泳(4℃,4 min)、倾斜笼子(45°,12 h)、转换昼夜节律24 h、制动2 h、热刺激40℃，5 min。每天随机安排1种刺激，每种刺激重复2~3次。

1.2.2 给药方法 低、中、高剂量组和盐酸氟西汀组分别按正常成人(60 kg体重)与大鼠(200 g体重)体表面积折算。对照组不灌药，模型组每日灌胃2 ml生理盐水，低剂量组每日灌胃含生药0.5 g舒郁宁心中药2 ml，中剂量组每日灌胃含生药1.5 g舒郁宁心中药2 ml，高剂量组每日灌胃含生药5.0 g舒郁宁心中药2 ml，盐酸氟西汀组每日灌胃含盐酸氟西汀0.4 mg/ml混悬液2 ml。造模成功后于第22天起连续给药3周。

1.2.3 旷场试验 旷场装置由不透明材料制成，底面为75×75 cm的正方形并被等分为25个正方形格，周壁高45 cm。将大鼠置于中心方格内，观察大鼠在3 min内穿越格数(3爪均进入的方格方可记数，为水平运动得分)、后肢直立次数(两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分)。每只大鼠进行1次测定，每次3 min。由2位观察者打分，取均值。分别于第0、21、42天测定。旷场试验的水平运动减少反映动物的活动度降低；垂直运动减少反映动物对新鲜环境的好奇程度降低，探索行为减少。

1.2.4 免疫组化 旷场试验结束后，所有大鼠10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，暴露心脏，以生理盐水(37℃)约250 ml经升主动脉灌注冲洗后，灌注4%多聚甲醛溶液(4℃,pH=7.4)200 ml，直至动物四肢僵硬。断头取脑，脑组织置于10%福尔马林溶液中固定24 h，参照大鼠脑立体定位图谱[5]对大鼠海马组织取材，常规脱水，浸蜡包埋，置于APES防脱玻片上(片厚4 μm)。60°烤片4 h，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，0.01 mol/L PBS(pH=7.2~7.4)浸洗2 min，共3次；3%H2O210 min，PBS浸洗2 min，共3次；浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)。微波热修复后，滴加一抗 Bcl-2(1∶150)、Bax(1∶300)，阴性对照组加0.01 mol/L PBS代替一抗，4℃冰箱孵育过夜，室温复温30 min后PBS浸洗5 min，共3次后滴加非生物素二抗，湿盒中室温30 min，PBS浸洗5 min，共3次，DAB显色光镜下控制时间，常规脱水，透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察，摄片。

1.2.5 图像分析 采用Image Pro plus 5.1图像分析系统测定每张照片的平均光密度值(AOD)，每张切片同一部位取5个不同的视野，所得数据以(±s)表示。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，所有计量数据以(±s)表示，进行正态性检验，多个样本均数比较采用方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验法。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 旷场试验 造模后，模型组水平运动得分、垂直运动得分均明显低于对照组(P<0.01)，与其他组比较无显著性差异(P>0.05)。给药后，模型组水平运动得分、垂直运动得分明显低于对照组(P<0.01)，高、中、低剂量组和盐酸氟西汀组均明显高于模型组(P<0.01)。见表1。

2.2 Bax和Bcl-2免疫组化 Bax蛋白阳性表达为黄色或棕黄色染色，染色深浅不一，主要位于细胞质中，胞核不染色。模型组表达明显强于对照组(P<0.01)，高、中剂量组和盐酸氟西汀组与模型组比较阳性表达降低(P<0.05)。见表2。

Bcl-2蛋白阳性表达为染色深浅不一的黄色或棕黄色染色，主要在细胞质中表达，胞核不染色。Bcl-2在模型组中阳性表达最弱，而在对照组中表达最强，高、中剂量组和盐酸氟西汀组表达均较模型组增强(P<0.05)。见表2。

表1 旷场行为学测定比较

表2 各组大鼠海马组织中Bax和Bcl-2阳性表达平均光密度值

3 讨论

慢性轻度不可预见性的应激抑郁模型主要模拟了人类抑郁的快感缺乏、运动能力及社会交往能力下降、探索行为能力下降、侵犯攻击能力缺陷、性行为能力下降等症状，是国际上公认的抑郁症模型，文献报道，慢性应激引起的抑郁状态及行为异常可保持数月[6]。

海马是边缘系统重要组成部分，参与情绪、学习和记忆、行为、免疫等的调节，它的损伤在各种应激所致疾患中起到关键作用[7]。慢性应激增加海马神经元细胞凋亡，引起海马结构和功能的变化，参与抑郁症的发病[3]。

本研究结果显示，造模成功后经过氟西汀和舒郁宁心中药干预，大鼠海马区凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达发生了变化，提示舒郁宁心汤可能是通过调节大鼠海马区凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax来对抗海马神经元细胞凋亡，从而发挥抗抑郁的作用。

[1]沈渔邨.精神病学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2009:426-429.

[2]Duman RS,Kehne JH.Depression[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2007,6(3):161-162.

[3]谢守付,马慧,刘伟,等.抑郁症模型鼠海马神经元细胞凋亡的初步研究[J].中国神经精神疾病杂志,2004,30(5):342-345.

[4]Winner P,Towell A,Sampson D,et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress,and its restoration by a tricyclic antidepressant[J].Psychopharmacology,1987,93:358-364.

[5]诸葛启钏,译.大鼠脑立体定位图谱[M].3版.北京:人民卫生出版社,2005:43-51.

[6]De Vry J,Schreiber R.The chronic mild stress depression model:future developments from a drug discovery perspectivel[J].Psychopharmacology,1997,134:349-350.

[7]董爱国,赵丽丽,李海红.BDNF在抑郁症发病机制中的作用及其抗抑郁作用机制的研究进展[J].中国医疗前沿,2011,6(6):16-18.