生长抑制DNA损伤基因45的功能及其作用

陈 萍 综述 陈朝红 审校

细胞受到致DNA损伤刺激后将会启动一系列信号通路抑制细胞周期，开始进行DNA修复，若修复完成则细胞周期将继续，若不能成功修复的细胞则进入细胞凋亡程序，可有效清除有恶变潜能的细胞，进而减少细胞癌变的发生。肿瘤的发生正因为这样的网状的信号通路中某个或多个环节发生改变，使细胞生存和凋亡的平衡失调，在外界环境因素和体内遗传因素的共同作用下，细胞分裂异常、无限增生形成恶性肿瘤。

生长抑制DNA损伤基因45(Gadd45)

Fornace等［1］用紫外照射和甲基磺酸甲脂(Methyl Methane Sulfonate，MMS)处理中国仓鼠卵巢细胞后造成其DNA损伤，筛选出49个cDNA表达发生改变的克隆，第45个克隆被命名为生长抑制DNA损伤基因45(Gadd45)。Gadd45基因编码由3种结构相似、相对分子质量较小的(18kD)酸性核蛋白Gadd45α、Gadd45β、Gadd45γ 组成，它们的同源性为55%～57%［2］，它在细胞胞质中也有表达。Gadd45基因家族作为DNA损伤修复的重要相关基因家族之一，多种DNA损伤因素(如电离辐射、紫外线、甲基甲磺酸甲酯、血清饥饿、各种化疗药物)作用后使Gadd45家族的基因表达迅速增加［3］，伴随着DNA修复机制启动。

Gadd45家族理化特性、空间结构和表达分布

人Gadd45α基因位于染色体1 p31.2，有4个外显子，mRNA全长1398 bp(NM_001924)，编码165 aa的蛋白(NP_001915)。Gadd45α广泛表达在正常组织中，特别是静息期的细胞。Gadd45α在Gl期表达水平最高，S期则显著下降。蛋白质数据库(Genecards)分析表明，Gadd45α在人肝、肾、脾、肺等组织表达较高，在相应的肿瘤组织表达均下降，但在卵巢、大肠、甲状旁腺等组织的肿瘤中有较高水平的表达，说明Gadd45α在不同组织中的功能可能不尽相同。人Gadd45β基因位于染色体9 p13.3，有4个外显子，mRNA全长是1393 bp(NM_015675)，编码160 aa的蛋白(NP_056490)。Gadd45β是进化保守的基因，与其他成员结构相似。Genecards分析表明，Gadd45β在肾、肺、乳腺等肿瘤组织表达下降，而在淋巴结及脑肿瘤组织则表达上调。Gadd45γ基因位于染色体9 q22.1～q22.2，有4个外显子，mRNA全长1087 bp(NM_006705)，编码蛋白159 aa的蛋白(NP_006696)，Gadd45γ主要表达于细胞核内。Genecards数据表明，Gadd45γ在胎盘中表达较高，在肾、肺、乳腺、甲状腺等肿瘤组织表达下调，而在淋巴结、皮肤以及脑组织肿瘤中表达上调。

Gadd45家族成员的功能与作用模式

Gadd45家族成员参与细胞周期抑制、DNA修复、DNA去甲基化、调节细胞生存与凋亡，也在肿瘤发生发展中发挥着重要作用。它们的生理功能受增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶1(cdk1)、p53，p21、有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶4/7(MEKK4/7)及p38等影响。

Gadd45家族参与细胞周期的调节 Gadd45家族在细胞周期调节方面发挥着重要作用。Vairapandi等［4］发现敲除人内皮细胞和成纤维细胞内源性的Gadd45家族蛋白，将损害G2/M细胞周期检查点;过表达Gadd45α的人原代成纤维细胞生长停滞于G2/M期;Gadd45家族蛋白介导的G2/M细胞周期抑制依赖于野生型p53，p53突变的成纤维细胞未见G2/M细胞周期抑制。Gadd45α基因敲除的小鼠表现出与p53基因敲除小鼠相似的特征，即染色体结构不稳定、辐射致癌率增加等，可能是G2/M期进程损害或DNA 损害所致［5］。Zhang等［6］在对 p53 敲除的肺癌细胞系H1299研究中发现，异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导异位Gadd45家族表达，抑制细胞生长，停滞在G1期的细胞明显增加［6］。Chakravarty等［7］用高渗［600 mOsmol/(kg·H2O)］甘露醇、山梨醇、NaCl及KCl等物质分别刺激肾脏内髓小管后发现，Gadd45α、Gadd45β 和 Gadd45γ mRNA 及蛋白表达均明显升高。进一步研究发现，在高渗条件下肾小管细胞的DNA发生断裂，Gadd45家族蛋白表达增加能够抑制有丝分裂，促使G2/M期细胞周期抑制，细胞进行DNA修复，当修复完成后细胞又开始增生［8］。尽管数小时后肾小管细胞还是处于高渗状态，但细胞又开始增生，这与经典的DNA损伤反应非常相似(图1)。

图1 经典的DNA损伤反应［8］

因此，推测最初的细胞周期抑制是为DNA修复提供足够的时间，当修复完成后细胞又开始增生。Pippin等［9］发现C5b-9刺激足细胞可导致足细胞DNA损伤，Gadd45家族蛋白表达上调并伴随p53，p21表达增加，表明Gadd45家族蛋白可能参与受损足细胞周期抑制及DNA修复过程。Gadd45家族蛋白通过与p21相互作用对G1期产生抑制;与Cdc2/cyclin B1复合物的相互作用使该激酶复合物分离而抑制Cdc2活性，从而抑制G2/M期细胞生长［10］。

Gadd45家族参与细胞凋亡的调节 Gadd45家族参与细胞凋亡，Qiu等［11］对小鼠Thy-1肾炎模型的研究发现，过表达Gadd45γ的小鼠，膜攻击复合物C5b-9介导的系膜细胞凋亡明显增加;而Gadd45γ基因敲除的小鼠C5b-9介导的系膜细胞凋亡明显减少，表明Gadd45γ参与了C5b-9介导的系膜细胞凋亡。阻断M1白血病细胞系Gadd45β表达抑制转化生长因子β(TGF-β)诱导的细胞凋亡，这表明Gadd45β可能介导了TGF-β诱导的细胞凋亡［12］。Yoo等［13］通过对 AML12 小鼠肝细胞系的研究发现，TGF-β通过smad2，smad3及smad4的通路使Gadd45β的表达增加，进而激活p38并诱导细胞凋亡。IPTG诱导的Gadd45β表达将加速M1细胞系中TGF-β诱导的细胞凋亡，该作用在H1299细胞系中表现更明显［14］。Gadd45家族蛋白可结合在MEKK4/有丝分裂原活化原白三激酶1(MTKI)的N末端，激活MTKI从而活化对细胞的凋亡起着重要促进作用的c-JNK N端激酶(JNK)/P38信号通路［15］。IκBβ 激酶通过结合核因子 κB(NF-κB)的p50亚基，提高Gadd45α的表达从而启动有丝分裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)/JNK通路，参与细胞凋亡的调控［16］。Bim是Bcl-2家族的一员，该蛋白在细胞骨架和线粒体表达定位，Bim诱导的细胞凋亡与其由细胞骨架向线粒体的转位有关。Gadd45α诱导引发的细胞骨架稳定性降低，导致Bim从细胞骨架向线粒体转移。在线粒体上积累的Bim蛋白与线粒体膜稳定蛋白Bcl-2发生相互作用并使Bax从Bcl-2/Bax复合体中解离出来，形成Bax寡聚体。Bax寡聚体最终促使线粒体外膜通透性增强，导致细胞色素C由线粒体膜间隙释放进入胞质，诱导细胞凋亡发生［17］。

Gadd45家族蛋白参与细胞生存调节 Gupta等［18］对Gadd45α和Gadd45β基因敲除的小鼠的研究发现，Gadd45α与Gadd45β作为抗凋亡基因能够提高受到损伤刺激的造血细胞的存活率［18］。与表达Gadd45家族蛋白的细胞相比，不表达的细胞对紫外线照射更加敏感，DNA的修复减少，细胞凋亡增加。研究发现Gadd45家族蛋白能够与紫外线损伤的 DNA 相结合，参与DNA的修复［19］。NF-κB/IκB信号转导途径对于细胞生存非常关键。Zazzeroni等［20］对 B细胞的研究发现，CD40通过NF-κB通路诱导Gadd45β表达，抑制Fas介导的细胞凋亡。Zerbini等［21］研究表明 NF-κB 介导细胞存活依赖 Gadd45α 和 Gadd45γ，NF-κB活化后进入细胞核使其表达下调进而使MKK4/JNK活性降低，最终实现细胞逃逸凋亡;抑制癌细胞的NF-κB会导致Gadd45α和Gadd45γ表达明显上调，MKK4/JNK活化和肿瘤生长抑制，可见 Gadd45α和 Gadd45γ在NF-κB介导的肿瘤存活中发挥重要的调节作用。Gupta等［22］研究发现在Gadd45α缺失型造血细胞中，不仅NF-κB活性缺失，p38活性亦受损，当在野生型造血细胞中加入p38抑制剂，IκB同样未被磷酸化和降解，提示Gadd45α通过p38磷酸化IκB激活NF-κB从而启动存通路保护造血细胞对抗紫外线诱导的细胞凋亡。Gadd45既参与细胞凋亡又参与了细胞生存方面的调节，这取决于细胞的受损程度。若DNA损害较轻细胞能够通过自身的修复机制完成修复，此时Gadd45家族则通过活化p38/NF-κB或者抑制MKK7/JNK信号通路发挥抗凋亡作用而促进细胞生存;若DNA受损较重机体通过自身的能力不能修复，则Gadd45家族通过TGF-β/MEKK4/p38/JNK信号通路促进细胞凋亡。

Gadd45家族蛋白在肿瘤发生中发挥着作用Hollander等［5］发现，Gadd45α 敲除小鼠在紫外线照射后肿瘤形成的易感性增加，与此观察相一致的是Gadd45α缺失的细胞染色体不稳定。2006年，Tront等［23］建立了一个Gadd45α缺失、同时用Ras诱导乳腺癌的小鼠模型发现，Gadd45α的敲除能够加速Ras诱导的乳腺肿瘤形成，其生长速度更快，更具侵袭性，其机制是JNK与p38活性的下降致凋亡减弱，Ras诱导的乳腺肿瘤衰老减慢。目前仅有Gadd45在胰腺导管癌中发生突变的报道，在第4个外显子发生突变，突变率达13.6%，且mRNA和蛋白表达水平均增加［24］，Gadd45α突变后G2/M期生长抑制和诱导凋亡等正常功能在胰腺癌中发生改变，RNAi干扰Gadd45α表达后可减慢肿瘤增生速率并诱导凋亡。提示Gadd45α突变不仅不能抑制肿瘤生长，还可能获得了促生存的功能，并参与肿瘤发生发展［25］。Gadd45γ在肿瘤组织中少有突变，其启动子的CpG岛是肿瘤特异的甲基化靶序列，很多肿瘤因Gadd45γ启动子被甲基化而出现Gadd45γ表达降低或缺失，其比例为非霍奇金淋巴瘤85%，霍奇金淋巴瘤50%，鼻咽癌73%，宫颈癌50%，食管癌29%，肺癌40%。在无Gadd45γ突变的肿瘤中，启动子的超甲基化状态可通过去甲基化试剂逆转，这可作为一个新的肿瘤治疗方法［26］。过表达Gadd45β将抑制小鼠垂体性腺瘤的形成，而在促性腺细胞上过表达Gadd45β将会抑制其增生，说明Gadd45β能够抑制肿瘤形成，细胞核受体CAR能够与Gadd45β通过相互作用来抑制 MKK7介导的JNK通路的磷酸化进而对小鼠肝细胞癌发挥抑制作用［27］。

Gadd45家族蛋白与DNA去甲基化 Gadd45家族蛋白介导DNA去甲基化，Gadd45基因在未受刺激对表达较低，仅在受到各种刺激后才会表达增加，Gadd45家族蛋白介导的DNA去甲基化也与细胞对各种刺激的反应有关。研究显示，钙离子可刺激分化中表皮细胞的Gadd45α与Gadd45β表达上调，并诱导分化标志 S100P的 DNA去甲基化［28］。神经元的电活动刺激可诱导Gadd45β表达一过性增加，Gadd45β能够通过DNA去甲基化来调节神经元的发生［29］。Gadd45β通过调节成年海马中的特定基因的启动因子的活跃的去甲基化来促进神经元新生。Gadd45β通过调节神经发生基因如FGF-1和BDNF的去甲基化从而发挥其营养神经元和促进树突生长的作用［30］。Gadd45α对MMS诱导的碱基损伤的碱基切除修复是非常必要的，Gadd45α在核酸切除修复中发挥作用，它有助维持染色体稳定，结肠癌细胞Gadd45α敲除后，将会导致核酸切除修复失败，并对紫外线过度敏感［31］。

Gadd45家族蛋白与年龄相关的疾病、寿命及老化相关 研究发现老年痴呆症患者神经元中Gadd45家族蛋白表达升高，能够阻止β淀粉样蛋白聚集所诱导的神经元凋亡。多巴胺刺激神经母细胞瘤细胞可见Gadd45家族蛋白高表达，多巴胺氧化过程中产生活性氧及活性醌类具有神经毒性，高表达的Gadd45家族蛋白在该过程中发挥保护作用［32］。曲格列酮为治疗2型糖尿病的药物，它能够使Gadd45β表达显著升高，Gadd45β通过抑制肿瘤坏死因子α/JNK信号通路以减轻胰岛素抵抗。胰岛素能够通过激活mTOR信号通路而诱导Gadd45b转录［56］，mTOR信号通路与年龄相关疾病、寿命及老化相关［33］。Gadd45家族蛋白的表达受到长寿相关基因LAGs、SIRT1以及FOXO的调节，用RNA干扰技术敲除SIRT1将会导致FOXO介导的Gadd45家族蛋白表达明显降低［34］。最新研究表明，过表达Gadd45家族蛋白能够使果蝇的寿命延长，并且使果蝇幼虫神经母细胞单股DNA断裂减少［35］。

Gadd45家族蛋白与其他细胞蛋白的相互作用Gadd45家族蛋白与其他细胞蛋白相互间作用复杂，一起参与细胞周期调节及应激的应答反应(图2)［36］，与 Gadd45 家族相互作用的蛋白有 PCNA、cdk1、p21、MEKK4、MKK7、p38 及 JNK。研究表明，Gadd45家族蛋白与PCNA相互作用能够促进核苷酸的切除修复［22］，与cdk1相互作用能够抑制cdc2/cyclinB1复合物的激酶活性，使细胞不能顺利由G2期向M期转变，进而导致细胞生长抑制［10］，与p21相互作用能增加p21的CDKI的活性，促使G1期生长抑制［9］。Chi等［2］研究者证实，Gadd45 家族蛋白的C端能与MEKK4N端连接进而激活该激酶。Gadd45家族成员之间可形成同构或者异构的聚合体，Gadd45β在内源性NF-κB介导的抗凋亡作用中发挥关键作用，在对成纤维细胞的研究中发现该机制与MKK7及上游的JNK有关［25］。Gadd45家族与不同的蛋白相互作用而表现出其不同的作用，这可能与Gadd45家族蛋白在不同的系统表达水平、细胞定位及转录后调控机制不同所决定的。

图2 Gadd45家族与其他胞内蛋白的相互作用［36］

Gadd45:生长抑制DNA损伤基因45;MEKK4:有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶4;MKK7有丝分裂原活化蛋白激酶激酶7;JNK:c-JNK N端激酶

小结:Gadd45作为一个DNA损伤和修复相关的基因家族，其编码的蛋白参与细胞周期抑制、DNA修复、DND去甲基化及细胞生存与凋亡的调节，在肿瘤形成方面也发挥重要作用，它们还与年龄相关的疾病寿命及老化相关，亦涉及神经元的损伤修复等方面。目前发现Gadd45参与肾小管、足细胞DNA损伤修复，介导了膜攻击复合物C5b-9诱导的系膜细胞凋亡，还可能与IgA肾病的进展相关。我们对局灶节段性肾小球硬化患者的研究发现，肾小球Gadd45β基因mRNA及蛋白的表达水平明显高于正常范围，Gadd45β蛋白在足细胞上表达，且患者Gadd45β蛋白的表达水平与患者蛋白尿呈正相关(未发表资料)，因此我们推测Gadd45β可能参与了FSGS患者足细胞损伤过程，其机制尚在研究。总之，Gadd45家族成员在肾脏病领域的研究有待进一步深入。

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