HPLC同时测定菟丝子不同炮制品中5种主要活性成分含量

肖 岚，杨梓懿，石继连

（湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

菟丝子为旋花科植物菟丝子（Cμscμta chinensis Lam）的干燥成熟种子，具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻的功效，临床上用于阳痿遗精、尿有余沥、遗尿尿频、腰膝酸软、目昏耳鸣、肾虚胎漏、胎动不安、脾肾虚泻、白癜风等症[1]。菟丝子质地坚硬，不易粉碎，有效成分难于溶出，历代菟丝子炮制方法多样，常用的有清炒、盐炙、酒炙、制饼等。黄酮类是菟丝子中研究较多且具特征性的成分，其中的槲皮素、金丝桃苷等具有多种药理活性，菟丝子总黄酮具有改善实验性心肌缺血、调节机体免疫、刺激内分泌等多种功能[2-4]。杨青月等采用HPLC 比较了菟丝子三种炮制品中3 种黄酮类成分，考察范围并不全面，有效成分检出含量低[5]。本研究采用高效液相色谱法，建立了5 种主要药效成分绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素含量分析方法，并对菟丝子生品、酒炙品、盐炙品、清炒品、菟丝子饼进行了含量测定。

1 仪器与试药

Agilent 1200 高效液相色谱仪，配G1329A 自动控温进样器及G1314B 可变波长检测器 （Agilent 公司）；色谱柱为Kromasil ODS-1 柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；ΜV- 265 型分光光度计(日本岛津)；FZ102 微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ5200DE 型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；Item AR1140 分析天平和Item AR5120 电子天平 （Ohaμs Corp.Pine Brook.NJ.ΜSA）。

绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号分别为 110753 -200413、111521 -201004、100080-20090、110861-200606、10860-200407)，黄酒( 湖南湘窖酒业有限公司，批号：XK16-0300934)，加碘精制盐(市售)，甲醇为色谱纯；水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

菟丝子（湖南海川医药有限公司）经湖南中医药大学鉴定教研室周日宝教授鉴定为旋花科植物菟丝子Cμscμta chinensis Lam.的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 菟丝子炮制品的制备[6-7]

2.1.1 生菟丝子 取原药材，除去杂质，淘洗干净，干燥，密闭保存，备用。

2.1.2 清炒菟丝子 取净菟丝子，置炒制容器内，用文火加热，炒至微黄色，有爆裂声，取出放凉，密闭备用。

2.1.3 盐炙菟丝子 取净菟丝子，加盐水拌匀，闷润，待盐水被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒至略鼓起，微有爆裂声，并有香气溢出时，取出放凉，密闭备用。每100 g 菟丝子用食盐2 g。

2.1.4 酒炙菟丝子 用黄酒代替盐水按“2.1.3”项下方法操作即得。每100 g 菟丝子用黄酒20 mL。

2.1.5 酒菟丝子饼 取净菟丝子，加适量水煮至开裂，不断搅拌，待水被吸尽后，全部呈黏丝稠粥状时，加入黄酒和白面拌匀，取出，压成饼，切成小方块，干燥，密闭备用。每100 g 菟丝子加黄酒15 g，白面粉15 g。

2.2 供试品溶液制备

分别称取上述菟丝子不同炮制品适量，用粉碎机粉碎（过20 目筛），取粗粉各约5 g 精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称质量，超声（50 V）30 min 后称质量，补足减失的质量，离心，取上清液，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

Kromasil ODS-1 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，0～10 min，25% A；10～15 min，25%～45%A；15～20 min，45%～65% A；20～27 min，65%～70%A。流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：360 nm；进样量：10 μL。按照上述色谱条件进行测定，结果显示，各待测组分峰与其相邻峰均能达到基线分离，保留时间在27 min 内，对照品与代表样品（清炒品）的色谱图见图1。

图1 绿原酸等5 种对照品与菟丝子样品的HPLC 图

2.4 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品绿原酸2.8 mg、金丝桃苷5.0 mg、槲皮素5.0 mg、山柰酚5.4mg、异鼠李素5.5 mg，加甲醇溶解，配成每毫升含绿原酸140.0 μg、金丝桃苷350.0 μg、槲皮素25.0 μg、山柰酚43.2 μg、异鼠李素5.5 μg 的混合对照品溶液。

2.5 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液3、5、7、9、12、15 μL依次进样，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y）、进样量（μg）为横坐标（X），绘制标准曲线，回归方程和线性范围见表1。

表1 回归方程和线性范围

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液，在“2.3”项下条件下，连续进样6 次，测定峰面积，分别计算峰面积的RSD为：绿原酸0.4%，金丝桃苷 0.2%，槲皮素1.2%，山柰酚1.5%，异鼠李素1.3%。表明仪器的精密度良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一菟丝子炮制品 （清炒品） 粉末6份，每份2 g，按“2.2”项下操作制备供试品溶液，按“2.3”项下条件测定，记录各色谱峰峰面积。分别计算绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素的平均含量（RSD）分别为5.74%（1.9%），10.09%（1.6%），0.66%（1.5%），1.25%（1.8%），0.13%（1.9%）。表明本方法测定重复性较好。

2.8 稳定性试验

精密吸取菟丝子炮制品（清炒品）供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别在0、1、2、4、6、8 h 进样，测定菟丝子炒制品中5 种被测成分的峰面积，计算RSD，结果8 h 时绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素峰面积的RSD 分别为0.5%，0.2%，1.2%，0.5%，1.9%。表明在8 h 内样品的稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称定已知含量的菟丝子炮制品（清炒品）粉末6 份，每份2.5 g，精密称定，置于25 mL 容量瓶中，按“2.2”项下方法操作制备供试品溶液。每份准确加入混合对照品溶液2 mL，按“2.3”项下色谱条件进行测定，结果见表2。

表2 菟丝子炮制品（清炒品）粉末加样回收率 （μg）

2.10 样品含量测定

精密称取菟丝子不同炮制品粉末各3 份，每份5.0 g，按“2.2” 项下方法操作制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算菟丝子不同炮制品中绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素的含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 流动相的选择

表3 菟丝子不同炮制品中5 种主要成分含量测定 （±s，n=3，%）

表3 菟丝子不同炮制品中5 种主要成分含量测定 （±s，n=3，%）

炮制品生品菟丝子清炒菟丝子盐炙菟丝子酒制菟丝子菟丝子饼绿原酸4.57±0.01 5.77±0.03 5.13±0.06 5.57±0.01 3.87±0.02金丝桃苷7.57±0.03 10.08±0.05 9.46±0.04 10.43±0.06 8.79±0.04槲皮素0.291±0.001 0.672±0.003 0.622±0.002 0.591±0.001 0.294+0.003山柰酚1.23±0.01 1.24±0.01 1.52±0.01 0.92±0.02 0.70±0.01异鼠李素0.100±0.001 0.117±0.001 0.157±0.002 0.187±0.002 0.089±0.001

本实验曾选用甲醇-0.4%磷酸水溶液进行等度洗脱，结果表明采用等度洗脱，色谱峰达不到分离要求，选择甲醇-0.4%磷酸水溶液梯度洗脱，出峰时间短，无其他成分的干扰，在本色谱条件下绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品保留时间分别为9.1、20.1、22.8、24.5、25.1 min。在本色谱条件下得到的色谱峰形和分离度均好。

3.2 检测波长的选择

分别取绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品溶液在300～400 nm 范围内进行紫外光谱扫描，结果在360、367 nm 处均有较大吸收，360 nm 处吸收值更大，干扰最少，故选360 nm 作为检测波长。

3.3 不同炮制品各成分含量的差异

根据测定结果可知，不同菟丝子炮制品中绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素含量有较大差异。清炒品中绿原酸含量比生品增加26.3%，比盐炙品增加12.5%。绿原酸为缩酚酸，本身不稳定，易分解。炒制是利用短时间快速加热的方式进行，使得绿原酸相对稳定，在热水或醇溶液中的溶解度增大。炒制品中槲皮素含量最高，可能与菟丝子中金丝桃苷、芦丁等黄酮苷类物质受热发生分解，增加了槲皮素的溶出有关。与酒炙品相比较盐炙品中山柰酚含量增加，但金丝桃苷含量降低，可能是由于用盐水润制过程中，盐水渗透到药材内部，有助于水、醇溶性物质的溶出，但对于黄酮苷类的溶出不利。酒炙品中金丝桃苷和异鼠李素的含量最高，分别是10.43%和0.187%。酒炙后金丝桃苷溶出增加得最多，这对于解释酒炙增强温肾壮阳的作用具有一定意义，但是酒炙品中黄酮类成分为何略高于盐炙品还需进一步研究。

菟丝子生品质地坚硬，不易粉碎，有效成分较难溶出。本实验采取短时间高温加热的方式进行炮制加工，结果有利于菟丝子有效成分的溶出，提示临床上菟丝子宜用炮制品不宜用生品。清炒法、盐炙法、酒炙法均可明显增加有效成分溶出，酒炙菟丝子饼工艺繁杂，对有效成分溶出影响不明显，现代应用并不广。黄酮类是菟丝子中研究较多且具特征性的成分，与菟丝子的补肝肾功能有密切关系，其中的槲皮素、金丝桃苷、山柰酚、绿原酸、异鼠李素等具有多种药理活性，不同炮制方法对其含量变化有影响，炮制作用机制仍需进一步研究。本实验可为制定菟丝子饮片质量标准和指导临床用药规范提供实验依据。

[1]丁安伟.菟丝子炮制历史沿革，中药炮制学[M].北京:高等教育出版社，2007:264-265.

[2]刘利萍，刘 建，陈海丰.中药菟丝子的研究进展[J].中药材2001，24(11):839-43.

[3]郭 澄，王雅君，张剑萍.菟丝子的化学成分和药理活性研究[J].时珍国医国药，2005，16(10)：1 035-1 036，

[4]孔伶俐，崔青娟，伊惠贤，等.HPLC 测定菟丝子中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量[J].中草药，2004，35(7):827-828.

[5]杨青月，张学兰，李慧芬，等.菟丝子不同炮制品中3 种黄酮类成分比较[J].中成药，2011，33(11)：1 945-1 948.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：290-291.

[7]李继红.HPLC 法测定菟丝子炮制前后化学成分含量[J].中兽医医药杂志，2009，10(5)：37-38.