心痛方对心肌缺血模型大鼠MPO活性及PS表达的干预作用

匡秀青，范金茹，姜益宏，陈 彤，杨金怡，那奕文

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

冠心病（CHD）是冠状动脉粥样硬化使血管腔阻塞，导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，是动脉粥样硬化（AS）最常见的疾病。就其发病机制而言，有氧自由基损伤、钙超载、炎症反应和血管内皮紊乱等，其中炎症反应机制受到日益重视。越来越多的证据表明，局部和全身的炎症在冠心病的发生发展中起重要作用[1]。冠心病急性心肌缺血是一个急性炎症反应过程，中性粒细胞是缺血区最早出现的效应白细胞，于缺血后30 min 开始浸润，24～48 h达高峰[2]，髓过氧化物酶(MPO)是一种血色素蛋白，它存于嗜中性多核细胞的嗜天青颗粒和巨嗜细胞中，MPO 活性是评价中性粒细胞浸润程度的可靠指标[3]。PS 属于细胞黏附分子中的选择素家族，其通过介导血小板-白细胞相互反应，参与炎症反应及血栓形成，在冠心病发病中起重要作用。心痛方是临床验方，研究表明心痛方治疗冠心病心绞痛疗效确切，并能显著降低冠心病患者的炎症指标，干预血小板、白细胞聚集及浸润[4]。本研究通过观察心痛方对心肌缺血大鼠模型心肌梗死面积、MPO 活性、PS 表达的影响，现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SD 大鼠，雄性，清洁级，体质量180～200 g，鼠龄8～10 w，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号 SCXK （湘）-2009-0004。

1.1.2 药物 心痛方（柴胡，郁金，九香虫，瓜蒌，桃仁，白芥子）购于湖南中医药大学第一附属医院中药房，在湖南中医药大学心血管实验室统一煎制成浓缩汤剂（含生药0.108 g/mL）；单硝酸异山梨酯（欣康，20 mg/片，批号00958453）由鲁南贝特制药有限公司提供。

1.1.3 试剂 MPO 试剂盒由南京建成生物试剂研究所提供，PS 抗体、PBS 缓冲液等由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.1.4 仪器 DH-140 动物人工呼吸机 （浙江医科大学仪器实验厂），RM6280 多导生理信号采集系统（成都仪器厂），UV-754 紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂），MIAS 医学图像分析系统 （北航公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 大鼠80 只，按体质量分层，再按随机数字表随机分组。分为A 组（假手术组）、B 组（模型组）、C 组（心痛方组）、D 组（欣康组），每组20只。

1.2.2 动物造模 参考文献方法[5-6]，采用结扎冠脉左前降支造成心肌缺血模型。穿线、或结扎后即刻记录心电图，以心脏左室前壁呈紫绀或Ⅱ导联ST 段弓背向上抬高大于0.1 mv 并持续0.5 h 以上为结扎成功标志 （S-T 段无改变者淘汰），3 h 后处死动物。

1.2.3 给药方法 均采用灌胃法给药，剂量均按60 kg 人体表面积换算，药物浓度为1 mL/100 g 灌胃容量配制[7]。常规饲养1 周后，心痛方组按1.08 g/kg剂量给药、欣康组按0.87 mg/kg 分别用配好的药液灌胃，模型组和假手术组分别给予灌服同等体积生理盐水，连续7 d，每天1 次，于第7 天灌胃30 min后进行实验。

1.2.4 心肌梗死面积测定 处死后摘取心脏，切片，NBT 染色液中37 ℃温孵15 min，梗死心肌不着色，正常心肌染成蓝色。数码相机拍摄心肌切片图像，采用图像分析仪分别测量心肌梗死面积 （心肌梗死部分占心肌横断面面积的百分比）。

1.2.5 心肌组织MPO 活性测定 取心肌组织4 ℃生理盐水洗净，称取100 mg 心肌组织置于试管中，加入预冷试剂二匀浆介质，在冰浴下用高速搅拌分散剂磨成1∶20（W/V）匀浆，取0.9 mL 5%组织匀浆，分别经37 ℃水浴15、30 min 及60 ℃水浴10 min，取出后立即在460 nm 处调光径1 cm，蒸馏水调零，分光度测定各管OD 值，最后按以下公式计算出MPO 活性，计算公式为：

MPO 单位/克湿重=(测定管OD 值-对照管OD值)／[11.3×取样量(g)]。

1.2.6 心肌组织PS 表达测定 取各组缺血区域心肌组织切片，采用免疫组化SABC 法染色封片镜检。黄褐色或棕色颗粒为阳性产物，在显微镜下用医学彩色图像分析系统测量阳性反应物的平均光密度（AOD）。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 心痛方对各组大鼠心肌梗死面积的影响

心痛方组、欣康组、模型组可见较明显心肌梗死，其中模型组最为显著，梗死面积最大，假手术组未见梗死，3 组心肌梗死面积与假手术组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），结果表明造模成功。心痛方组与模型组比较，梗死面积较小，差异有统计学意义 （P＜0.01），说明心痛方能缩小心肌梗死面积；欣康组与模型组比较，梗死面积较小，差异有统计学意义（P＜0.05）；心痛方组与欣康组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明心痛方和欣康均能缩小大鼠心肌梗死面积。结果见表1。

表1 各组大鼠心肌缺血模型心肌梗死面积比较 （n=8，±s）

表1 各组大鼠心肌缺血模型心肌梗死面积比较 （n=8，±s）

注：与假手术组比较*P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。

组 别假手术组模 型 组心痛方组欣 康 组药物剂量（g/kg）— —1.08 8.7×10-4心肌梗死面积（%）0 29.48±8.11*20.21±5.39*△△22.94±7.68*△

2.2 心痛方对心肌缺血大鼠模型MPO 活性的影响

心痛方组、欣康组、模型组与假手术组比，MPO活性明显升高，其中模型组升高最显著，说明大鼠心肌急性缺血时MPO 活性升高，表明髓过氧化物酶在大鼠急性心肌缺血中起到一定的促进作用，差异有统计学意义（P＜0.01）；心痛方组、欣康组与模型组比较，MPO 活性明显降低，差异有统计学意义 （P＜0.01，P＜0.05），心痛方组与欣康组比较，MPO 活性降低更明显，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；说明心痛方、欣康能抑制心肌MPO 活性，而心痛方作用更强。结果见表2。

2.3 心痛方对心肌缺血大鼠模型PS 表达的影响

与模型组比较，心痛方组、欣康组缺血心肌PS表达均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明心痛方、欣康能抑制PS 在缺血心肌中的表达；心痛方组与欣康组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠心肌缺血模型心肌MPO 活性、PS 表达比较 （n=8，±s）

表2 各组大鼠心肌缺血模型心肌MPO 活性、PS 表达比较 （n=8，±s）

注：与假手术组比较*P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。

组 别假手术组模 型 组心痛方组欣 康 组PS 表达（AOD）0.09±0.03 0.51±0.04*0.19±0.03*△0.20±0.03*△药物剂量(g/kg)— —1.08 8.7×10-4 MPO 活性（U/g）0.31±0.09 3.23±0.72*1.31±0.49*△△2.04±0.80*△

3 讨论

心痛方主要由柴胡、瓜蒌、白芥子、桃仁、郁金、九香虫等药组成，是依据全国名老中医王行宽教授“杂病治肝”理论演化而来，以疏肝豁痰化瘀法立方。方中柴胡为君药，疏肝理气，取“气行则血行”之意，使“肝气通则心气和”。瓜蒌、白芥子、桃仁为臣药，三者合用，豁痰化瘀、行气止痛以治标实；栝蒌性寒，既可防白芥子辛温伤阴之弊，又防治肝郁化火之势；郁金为佐，佐君药疏肝解郁，助臣药行气活血化瘀；九香虫为使，走窜络脉，理气止痛而不伤胃，并能理肝胃之气、行膈脘之滞以助脾胃之健运，以绝生痰之源。故总方功效以疏肝解郁理气为重，化痰与祛瘀并举，冀脉络通畅，气血安和，常用于治疗肝郁痰瘀气滞证冠心病心绞痛患者。

本研究结果表明：心痛方能缩小急性心肌缺血大鼠心肌梗死面积；抑制心梗心肌MPO 活性及PS表达，在抑制MPO 活性方面心痛方组优于欣康组。

MPO 是心肌损伤过程中中性粒细胞浸润的特异性指标，吴氏等观察大鼠心肌缺血再灌注模型中中性粒细胞与心肌损伤程度的相关性，表明心肌损伤的程度与心肌内中性粒细胞浸润数呈正相关，证明聚集在缺血区的中性粒细胞被激活，产生大量的氧自由基，对组织细胞产生损伤作用[8]。

PS 在血栓形成过程中起始动作用，放大炎症反应，并通过与P 选择素糖蛋白配体相互作用诱导促凝血颗粒产生，使机体进入血栓前状态，从而参与冠状动脉粥样硬化的形成和发展，与动脉粥样斑块的形成及其稳定性密切相关[9]。通过干预中性粒细胞的浸润、降低PS表达及其黏附作用可能是心痛方治疗缺血性心肌病变的作用机制之一。

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