清解活血汤对兔自身免疫性视网膜血管炎病理学变化的影响

宋 柯 张津京 李庆生 江 伟 张 红 镇 华

视网膜血管炎是一类累及视网膜血管的疾病，常同时伴有脉络膜和玻璃体炎症反应，病情重者可引起黄斑水肿等并发症，严重危害视力，甚至失明，一般难以治愈。我们结合多年临床经验，应用清解活血汤加减（即黄连解毒汤与桃红四物汤的合方加减）治疗视网膜血管炎取得了一定的疗效，并在前期的实验中对不同中药干预庆大霉素致青紫蓝兔视网膜血管损伤的动物模型进行了实验研究〔1〕。本实验在前人研究的基础上，采用玻璃体腔注射牛血清白蛋白建立自身免疫性视网膜血管炎模型，观察清解活血汤对该模型动物组织病理学的影响，期望能为视网膜血管炎及类似血管损伤性疾病的基础研究提供一些实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：青紫蓝兔40只，雌雄各半，体质量2～2.5 kg，购自北京天坛生物制品股份有限公司，许可证编号：SCXK（京）2009-0010。

1.1.2 中药制备：采用清热解毒活血方，组成：黄连10 g、黄芩 10 g、黄柏 10 g、栀子 10 g、紫草 10 g、红花10 g。购自北京燕北饮片厂，批号090816。经中药师鉴定并水煎制成浓缩液，高剂量组相当于临床剂量4倍；低剂量组相当于临床剂量2倍，具体按照《药理实验方法学》折算。

1.1.3 其它主要药物和试剂：地塞米松磷酸钠注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号0820221）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、弗氏完全佐剂（complete Freund’s adjuvant，CFA）、戊巴比妥钠、多聚甲醛（美国sigma公司）；苏木素-伊红（H-E）（天合力恩化学试剂公司，批号20031024）、戊二醛（Merck 公司）、丙酮（北京化工厂，批号 20021216）、树脂包埋剂（SERVA公司）。

1.2 主要仪器

直接检眼镜（HEINE公司）、手术显微镜（YZ20T4，苏州六六视觉科技股份有限公司）、眼底照相机（Topcon公司）、光学显微镜及数码照相装置（OLMPUS公司）、透射电子显微镜（HITACHI-7650，日本）。

1.3 造模与分组

1.3.1 模型制备：（1）预免疫（足底皮下注射）：将2%BSA生理盐水溶液与CFA等体积的混合乳液予青紫蓝兔双后足底皮下注射，每次各足底注射0.1 ml，共注射4次，每次间隔7 d。（2）终免疫（玻璃体腔注射）：足底末次注射完7 d后，各兔双眼玻璃体腔分别注射 BSA 生理盐水溶液 0.05 ml（含 BSA 25 μg）。

1.3.2 分组治疗：将40只实验兔随机分为5组，每组8只，分别为正常对照组、空白对照对照组、阳性对照组、中药高剂量组、中药低剂量组。正常对照组不做任何处理，其他4组动物进行造模，完成造模12 h后开始给药。空白对照组给予生理盐水灌胃，2次/日，5 ml/次；阳性对照组给予腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液，剂量按人每天10 mg折算，1次/日；中药各组给予不同浓度中药灌胃，2次/日，5 ml/次。

1.4 实验观察

1.4.1 大体状况：观察实验兔外观、足底注射部位、四肢关节等情况。

1.4.2 眼部体征：裂隙灯及检眼镜观察实验兔眼部情况。

1.4.3 光学显微镜观察：分别于给药7 d及14 d时，全麻状态下各摘除4只实验兔双眼。予4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色观察。

2 结果

2.1 大体状况观察

模型兔行第2次足底注射时，毛发稍有脱落、光泽欠佳，足底见溃疡；第3次注射时，颈背部毛发稀疏、部分脱落，全身消瘦，足底溃疡明显，1只实验兔双腿膝关节见类风湿性关节炎表现；第4次注射时，毛发大部分脱落，可见皮肤组织，皮下血管暴露，全身消瘦明显，足底溃疡范围扩大。

2.2 眼部体征

2.2.1 前房及玻璃体炎症表现：正常组未见异常。空白对照组玻璃体腔注射后12 h瞳孔缘见纤维性渗出，玻璃体轻度混浊。注射24 h后瞳孔缘渗出物增多，玻璃体混浊加重，眼底不清。注射后第5天玻璃体混浊减轻，第7天瞳孔缘纤维渗出物较前减少，玻璃体混浊明显减轻。第14天瞳孔缘渗出物基本消失，玻璃体混浊进一步减轻。阳性对照组及中药高低剂量组青紫蓝兔瞳孔缘纤维渗出物呈逐渐减少趋势，最后消失，玻璃体混浊变化与之大致相同。

2.2.2 眼底表现：正常组眼底未见异常。空白对照组玻璃体腔注射后12 h见视盘水肿，视网膜点片状出血，静脉呈节段状阻塞，近视盘处静脉粗大迂曲。注射后第7天见视网膜水肿，大量出血，动脉细，静脉粗大迂曲，第14天视网膜出血略减少，视盘水肿无变化。阳性对照组第14天视网膜出血减少，视盘水肿无明显变化，其余大致同空白对照组。中药高剂量组第7天眼底视盘水肿，视网膜见出血，部分色素紊乱，第14天视盘水肿明显减轻，视网膜出血明显减少，近视盘处可见部分静脉略粗大迂曲。中药低剂量组第14天视盘略水肿，出血减少呈点片状。

2.3 光学显微镜观察

最早出现变化的是RPE细胞和视网膜感光细胞，其次是神经节细胞层及神经纤维层。空白对照组玻璃体腔注射后第7天，视网膜水肿、出血，血管区域见大量红细胞及炎性细胞，玻璃体及脉络膜血管区也可见大量炎性细胞，感光细胞层排列紊乱，RPE细胞色素增多、迁移或团簇；第14天内、外颗粒层排列不齐，神经纤维层见局灶性坏死，感光细胞层排列紊乱、缺失中断。阳性对照组注射后第7天，视网膜高度水肿伴出血，神经纤维层部分坏死变性，外颗粒层部分缺失，感光细胞层与RPE层脱离，感光细胞部分消失；第14天视网膜水肿减轻，出血减少，内外颗粒层排列不齐。中药高剂量组第7天视网膜血管区域见大量红细胞及炎性细胞，感光细胞层排列紊乱；第14天时视网膜出血及炎性细胞明显减少。中药低剂量组第7天视网膜部分血管栓塞，周围炎性细胞浸润，内、外颗粒层排列不齐，神经纤维层局灶性坏死；第14天视网膜出血及炎性细胞均减少（图1）。

3 讨论

目前有关视网膜血管炎的发病机制尚不清楚，大多学者认为除感染和肿瘤等导致之外，主要由自身免疫反应引起。前人已进行了大量动物实验研究，如用猪视网膜S抗原联合弗式佐剂诱导大鼠葡萄膜炎，结果大鼠的眼底表现与特发性视网膜血管炎极为相似〔2〕，随后有学者使用牛视网膜S抗原、病毒、牛血清白蛋白、弓形体及犬弓蛔虫等成功造模〔3-7〕。

本实验参考前人造模方法〔3〕，使用牛血清白蛋白与弗试佐剂足底皮内注射及牛血清白蛋白玻璃体腔注射制作青紫蓝兔自身免疫性视网膜血管炎模型。模型动物眼部可见瞳孔缘渗出物，玻璃体炎症，视盘水肿，静脉节段性阻塞，视网膜水肿出血；大体见消瘦、毛发脱落、足底溃疡、关节炎；病理切片显示视网膜血管区域大量红细胞及炎性细胞，感光细胞层排列紊乱，RPE细胞色素增多、迁移或团簇，神经纤维层局灶性坏死，说明模型制作是成功的。另一方面，空白对照组、阳性对照组及中药高低剂量组青紫蓝兔眼前节和玻璃体炎症均由轻到重随之逐渐减轻，这是否说明牛血清白蛋白诱导的青紫蓝兔眼前节和玻璃体炎症具有自限性，尚有待于进一步研究证实。

西医对于视网膜血管炎尚无十分有效的治疗方法，目前主要给予糖皮质激素及一些免疫抑制剂等治疗，必要时予激光及玻璃体切割手术治疗，但目前对这些疗法的使用仍存在争议〔2〕。根据该病（突然）视力下降、玻璃体混浊以及眼底出血等特点，可归入中医 “暴盲”、“视瞻昏渺”、“云雾移睛”、“萤星满目”和“目血症”等范畴。中医眼科理论认为，眼底出血的病机主要是热毒壅盛，血热妄行，或阴虚火旺，虚火上炎，火灼脉络致血溢脉外，处方以清热解毒、凉血止血，或滋阴养血止血药物。导师李庆生主任医师在临床上应用清解活血汤加减（即黄连解毒汤与桃红四物汤的合方加减）治疗本病，发现确有一定疗效。我们在临床研究的基础上〔8〕，前期已用地塞米松、《千金要方》犀角地黄汤（用水牛角代替犀角）、黄连解毒汤和桃红四物汤等对庆大霉素致家兔视网膜损伤模型进行疗效观察〔1〕，结果发现地塞米松可明显减少早期出血，抑制炎症细胞数量，但长时间应用会加重炎症反应；犀角地黄汤中剂量对庆大霉素致视网膜损伤有明显的治疗作用；黄连解毒汤和桃红四物汤能明显改善视网膜出血及炎症反应，作用效果好于犀角地黄汤。因此本实验以清解活血汤作为干预手段，观察该组方对实验性视网膜血管炎的治疗效果。结果表明，清解活血汤可明显减轻模型兔视盘水肿、视网膜出血，高剂量组的治疗作用最好。从病理结果上看，无论造模后第7天还是第14天，中药高剂量组的视网膜损害、出血及炎性细胞浸润均明显轻于空白对照组和阳性对照组，也好于中药低剂量组。

清解活血汤是黄连解毒汤与桃红四物汤合方加减，方中黄连、黄芩、黄柏清热解毒，紫草、栀子、红花清热凉血止血。现代药理研究表明黄连解毒汤具有抗炎、抗菌、抗内毒素等多种作用〔9〕；红花可通过抑制去甲肾上腺素引起血管运动，增加血流量〔10〕，并通过抑制血浆纤溶酶原激活剂活性以减轻血管损伤〔11-12〕；紫草也具有抗菌抗炎等作用〔13〕。清解活血汤对视网膜血管炎模型动物的治疗作用可能与上述中药的药理作用有关。

综上所述，本实验应用牛血清白蛋白诱导兔自身免疫性视网膜血管炎，其眼部表现和病理改变均与视网膜血管炎接近，因此可作为一种良好的模型供将来研究使用。分组实验结果显示，清解活血汤能有效控制模型动物的视网膜出血及炎症反应，为这一组方的临床应用提供了实验支持，至于其治疗作用的具体机制，尚有待进一步的研究。

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