枸杞多糖对人视网膜色素上皮细胞脂褐素清除作用的影响

杨茂兰 董卫红 毕宏生 解孝锋 杜秀娟

视网膜色素上皮（retinalpigmentepithelium，RPE）细胞的主要功能之一是吞噬光感受器外节（photorecepter ourer segment，POS）脱落的膜盘，从而维持光感受器外节的更新和正常的视功能〔1〕。被吞噬的膜盘若不能被RPE细胞内的溶酶体完全清除，残留物质积聚则会形成脂褐素，它是具有特征性的一种脂质或蛋白质的聚合物，其含量与细胞的老化程度成正比〔2〕。RPE细胞内脂褐素的大量聚集会引起细胞结构和功能的改变，并引起一系列年龄相关性疾病，如年龄相关性黄斑变性。因此，清除RPE细胞内积聚的脂褐素，可能是阻止或者预防视网膜色素上皮老年性改变的重要手段。枸杞多糖有抗氧化、抗衰老、细胞保护、抗肿瘤、抑制炎症免疫反应、降糖降脂的功效〔3〕，已有文献证明其能够有效清除生物体内，包括皮肤、大脑、心脏、肝脏、肾脏及大小肠等器官积聚的脂褐素〔4〕，但是对于培养的人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelial，hRPE）细胞脂褐素的清除尚无报道。本实验旨在研究枸杞多糖对hRPE细胞脂褐素清除作用的影响，从而探讨枸杞多糖在预防或阻止视网膜色素上皮老年性改变中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及设备

二氧化碳细胞培养箱（Heal Force），OLYMPUS光学显微镜（日本奥林巴斯），高速冰冻离心机（Heal Force），低速离心机（安徽中科中佳），超微净化工作台（上海博讯实业），恒温水浴箱（江苏金坛荣华），流式细胞仪（Accuri C6），荧光显微镜（OLMPUS公司），透射电子显微镜（德国高视远望），12、24、96孔板（山东赛恩斯）。人视网膜色素上皮细胞株（hRPE-19细胞株）（上海瑞奇），DMEM培养基（高糖型）（美国Gibeo），胎牛血清（赛默飞世尔），胰蛋白酶（赛默飞世尔），Optiprep密度梯度液（美国Sigma），枸杞多糖（西安奥泽生物科技有限公司），细胞培养皿、细胞培养瓶（美国 Coming）。

1.2 枸杞多糖液配制

以枸杞多糖和DMEM高糖培养基配置浓度为10 mg/ml的枸杞多糖药液，进行0.22 μm微孔过滤灭菌处理，作为母液，4℃保存。根据实验需要，用DMEM高糖将母液稀释至 10 μg/ml、100 μg/ml、1 000 μg/ml 3个浓度，并分别置于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存。

1.3 人视网膜色素上皮细胞体外培养

将购得的hRPE细胞株解冻后，采用胰蛋白酶消化法消化体外培养的hRPE细胞株，以5×104个/ml的密度接种于50 ml培养瓶中，放在37℃、5%CO2培养箱静置培养，次日更换培养液，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，以后隔天更换培养液，待细胞接近铺满时按 1∶3 比例进行传代〔5〕。

1.4 猪光感受器外节的提取和纯化

猪POS提取纯化方法依据Chaintin MH等〔6〕报道的方法经改进后进行：从济南市历下区生猪屠宰场活体取猪眼球8只，湿房（4℃，400单位/ml庆大霉素的Ringer’s液）保存，用体积分数为75%的乙醇浸泡2 min，灭菌生理盐水充分冲洗后，移至超净工作台，PBS冲洗2次，冰上操作，将猪眼固定于自制眼球托，沿赤道部环形剪开，去除前节及玻璃体，分离取出视网膜神经上皮层，置于冰Ringer’s液，持续振荡20 s后静置10 s，重复10次，冰上静置40 min〔7〕，待大块视网膜组织沉淀后取上清以 4 000 r/min离心4 min，取沉淀置于配好的Optiprep梯度液（8%，10%，15%）的最上层，4℃下离心 45 min（Frc=12 000）。收集位于10%与15%梯度之间的粉色条带，分装于含10%FBS的DMEM/F12中，细胞数调整为2×107个/ml，用光学显微镜、透射电子显微镜进行观察鉴定。

1.5 hRPE脂褐素模型的建立

依据惠延年教授hRPE脂褐素模型建立方法〔8〕，将处于对数生长期的细胞浓度调整为5×104个/ml，接种于25 ml培养瓶中，并加入备好的POS，置于37℃、5%CO2培养箱中混养3周。用光学显微镜、透射电子显微镜予以观察鉴定。

1.6 实验分组及hRPE脂褐素清除的检测

将诱导成功的处于对数生长期的含脂褐素的hRPE细胞接种于12孔培养板中，共3块，第1块孔板12 h、第 2块孔板24 h、第 3块孔板48 h，细胞接种密度为5×106个/ml，24 h后更换培养液，每块孔板分成4个浓度组，每组为3个复孔，第1组不加枸杞多糖，作为空白对照组，其余为实验组，将2 ml浓度分别为 10 μg/ml、100 μg/ml、1 000 μg/ml的枸杞多糖培养基分别加入另3组各孔中，空白对照组加入等量的培养基，继续孵育，用0.25%的胰蛋白酶溶液消化培养12 h、24 h、48 h时的 hRPE细胞，制成单个细胞悬液，5×105～5×106个/ml，用流式细胞仪随机测定10 000个细胞内脂褐素的荧光值，计算其均数。上述实验重复测定3次。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 培养细胞的形态与鉴定

2.1.1 hRPE细胞：光学显微镜下，hRPE细胞呈长梭形（类成纤维细胞）或不规则形态，细胞单层贴壁生长，情况良好，胞浆丰富、透明，胞核透亮，细胞边界清晰（图1A），无或有少量色素（图1B）。

2.1.2 光感受器外节（POS）：光镜下，POS大小均一，形态类似，呈独立的细杆状（图2）。透射电子显微镜下，POS可见双层膜盘样，呈排列紧密的连续丝状，膜盘既有与外节长轴相垂直排列，亦有与外节长轴平行或斜行排列，其上附有细小黑色点状颗粒（图3）。证实为纯化的光感受器外节。

2.1.3 hRPE脂褐素模型：透射电子显微镜下，hRPE细胞内可见尚未被消化的膜盘结构（图4A），并可观察到细胞内出现大量高电子密度的均质小体和溶酶体，溶酶体内吞噬颗粒的周围形成多层次的板层结构。脂褐素形成，均质小体和板层小体的数量较正常细胞明显增多（图4B）。

2.2 不同浓度枸杞多糖对hRPE细胞脂褐素清除作用的影响

不同浓度枸杞多糖作用于含脂褐素的hRPE细胞后，实验组在任一时间的脂褐素荧光面积与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01），见下表。

表 不同浓度枸杞多糖作用不同时间对hRPE细胞脂褐素荧光面积的影响（±s）

表 不同浓度枸杞多糖作用不同时间对hRPE细胞脂褐素荧光面积的影响（±s）

注：两因素（浓度和培养时间）无交互作用，F=1.486，P=0.215；浓度效应，F=21.625，P=0.005；时间效应 F=16.225，P=0.001（两因素析因设计的方差分析）。同一培养时间，不同浓度枸杞多糖作用比较，①F=21.625，P=0.005；②F=20.915，P=0.001；③F=20.125，P=0.005（单因素方差分析）。各荧光面积数值对应的样本量=3

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3 讨论

脂褐素是细胞成长中出现的具有特征性的一种脂质或蛋白质的聚合物，在不同组织有丝分裂细胞的溶酶体内均可以找到，其含量跟细胞的老化程度成正比，因此常作为机体的“衰老标志”。在本实验中，用Optiprep密度梯度法提取猪光感受器外节（POS），得到较纯净的POS。脂褐素能够自发荧光，其荧光强度与含量成正相关，我们利用它的这一特点，用荧光光度法和流式细胞术测定其自发荧光值，定量反应细胞衰老的程度，为药物干预提供实验指标。

用不同浓度（10～1 000 μg/ml）的枸杞多糖作用于hRPE细胞后，流式细胞仪检测hRPE内脂褐素自发荧光值，浓度效应中，各组两两比较均存在统计学意义差异（P＜0.05）。各组脂褐素荧光面积随时间延长逐渐减小，同一时间段脂褐素荧光面积随枸杞多糖浓度增大逐渐减小，表明枸杞多糖能明显加强hRPE细胞对脂褐素的清除作用；枸杞多糖浓度为1 000 μg/ml时脂褐素荧光面积最小，即此浓度的枸杞多糖对hRPE细胞内脂褐素的清除作用最强。

我们的实验证实了枸杞多糖可以促进RPE细胞中脂褐素的清除，这对枸杞多糖是否可以预防及延缓视网膜色素上皮的衰老，以及对年龄相关性眼病如年龄相关性黄斑变性的预防治疗提供了新的思路。但是我们对药物作用后RPE细胞结构及功能的变化还没有进行深入的研究，例如视网膜色素上皮细胞内各种离子浓度的变化、氧化酶活性以及血管内皮生长因子水平的改变等等。同时，由于枸杞多糖成分复杂，清除脂褐素的具体作用成分和机制也有待进一步论证探讨。对于枸杞多糖是否能够阻止或者预防RPE的老年性改变还需要进一步的研究。

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