穴位注射川芎嗪抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管形成的实验研究

易细香 傅 培 徐 敏

视网膜新生血管形成，是导致糖尿病视网膜病变、眼底血管栓塞、缺血性眼病等最终视力丧失的重要原因，迄今尚无有效的药物治疗方法。本研究首次应用高浓度氧诱导C57BL/6J小鼠建立视网膜新生血管病变模型，通过新生血管内皮细胞核计数及血清血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量检测，观察太阳穴（颞浅动脉旁）注射和鼠尾静脉注射川芎嗪对视网膜新生血管形成的影响，旨在从组织形态学、分子生物学方面探讨注射川芎嗪抑制视网膜新生血管形成的机理，为治疗血管源性眼病开辟新的安全有效用药方式。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：鼠龄7 d的健康C57BL/6J幼鼠60只，性别不限，未断奶，与哺乳母鼠共同饲养，系清洁级动物，由广州动物实验室提供，动物合格证号：0097634。

1.1.2 主要设备与试剂：电脑氧气浓度控制仪、光学显微镜，VEGF检测相关设备均由我院中心实验室提供。小鼠抗小鼠VEGF单抗（SANTA CRUZ公司）；即用型SABC-AP免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）；盐酸川芎嗪注射液（20 mg/ml，常州制药厂生产，批号：001002）。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组：参考 Smith 等〔1〕和张正培等〔2〕的方法建立氧诱导的血管增生性视网膜病变幼鼠模型。取健康幼鼠（鼠龄出生后第7天）C57BL/6J 60只，随机分为正常对照组、模型对照组、穴位注射组、全身用药组，每组15只，与哺乳母鼠一起置于干燥密闭玻璃容器内，提供足够的食物及水，后3组予以持续高氧混合气体（75%氧气和25%氮气），在此高氧环境中饲养5 d后将幼鼠取出，回到正常空气环境下饲养，建立氧诱导视网膜新生血管病变幼鼠模型。根据Smith〔1〕的实验结果，该动物模型至鼠龄第17天时视网膜新生血管的发生率为100%。

1.2.2 给药方法：（1）穴位注射组：使用装有川芎嗪稀释液的微量注射器于小鼠右侧太阳穴进针1～3 mm，捻转刺激后推注川芎嗪注射液0.2 ml（稀释10倍，含川芎嗪 0.4 mg），每日 1次，连续 7 d。（2）全身用药组：鼠尾静脉注射川芎嗪稀释液0.2 ml（稀释10倍，含川芎嗪 0.4 mg），每日 1次，连续给药 7 d。（3）模型对照组：鼠尾静脉注射生理盐水0.2 ml，每日1次，连续给药7 d。

1.2.3 视网膜新生血管细胞核计数：采用双盲法，注射结束5 d后处死所有小鼠，取出右眼，4%多聚甲醛溶液固定24 h，脱水、透明、浸蜡，做6 μm厚连续切片，切片方向平行于角膜至视盘的矢状位平面。常规苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察结果。每只眼球间断取10个不含视盘的切片，相邻2个切片间隔60 μm（10个切片）。计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目，统计平均每只眼球每张切片突破内界膜的血管内皮细胞核数。

1.2.4 动物血清VEGF含量测定：小鼠处死后眼球采血。采用双抗体夹心法测定血清血管内皮细胞生长因子含量，操作方法按说明书进行。

1.3 统计学方法

使用SPSS 10.1软件建立数据库，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清VEGF含量

正常对照组、穴位注射组和全身用药组的血清VEGF浓度均低于模型对照组，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；穴位注射组与全身用药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表 1）。

表1 各组实验鼠血清VEGF含量（±s）

表1 各组实验鼠血清VEGF含量（±s）

注：与模型对照组比较，①P＜0.01，②P＜0.05；与穴位注射组比较，P＞0.05（独立样本t检验）。VEGF：血管内皮生长因子

组别 实验鼠数量/只 血清VEGF含量/(μg／L)正常对照组 15 9.28±1.26①模型对照组 15 18.31±4.33穴位注射组 15 13.35±2.41②全身用药组 15 12.37±3.11②③

2.2 视网膜新生血管内皮细胞核数

正常对照组15只眼中有5只眼见极少数突破内界膜的视网膜血管芽，其细胞核数为1～10个，其余10只眼均未见视网膜新生血管芽。造模各组均可见视网膜新生血管芽，发生率为100%。模型对照组的新生血管内皮细胞核数明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），说明造模是成功的。穴位注射组、全身用药组的视网膜新生血管内皮细胞核数均低于模型对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；穴位注射组与全身用药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表 2，图 1）。

表2 各组实验鼠视网膜新生血管细胞核计数结果（±s）

表2 各组实验鼠视网膜新生血管细胞核计数结果（±s）

注：与模型对照组比较，①P＜0.01，②P＜0.05；与穴位注射组比较，P＞0.05（独立样本 t检验）。

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3 讨论

大量研究表明，缺氧是导致视网膜新生血管形成的主要刺激因素，将出生后1周内的C57BL/6J幼鼠置于75%浓度氧的环境中连续生活5 d，即可见大量的视网膜新生血管形成〔1〕。很多细胞因子如VEGF参与了视网膜新生血管的形成过程〔3〕，缺氧可促进VEGF的合成〔4〕，VEGF表达持续增加可导致视网膜血管内皮细胞及视网膜色素上皮细胞过度增殖、微血管化，进而形成新生血管，引起明显的新生血管增生性视网膜病变的发生〔5-6〕。本文通过视网膜新生血管芽细胞核计数来判断视网膜新生血管的增殖程度，新生血管芽细胞核数越多表明视网膜新生血管增殖越严重。各组模型鼠血清VEGF含量及视网膜新生血管芽细胞核计数均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明 VEGF参与了模型鼠视网膜新生血管的发生。

视网膜新生血管形成，是导致糖尿病视网膜病变、眼底血管栓塞、缺血性眼病等视力丧失的重要原因。对于视网膜新生血管的治疗，迄今尚无有效的药物治疗方法。激光光凝、光动力疗法，玻璃体腔注射VEGF拮抗类药物，玻璃体切割术等均为有创治疗，可能导致视网膜脱离、眼内感染，寻找安全有效的治疗药物是目前眼科学界关注的问题。

中药川芎含有川芎嗪、阿魏酸钠、川芎内酯等，川芎嗪是其主要有效活性成分。川芎嗪有较强的扩张微血管作用，可改善微循环，降低血黏度，改善血液流变，并有降低毛细血管通透性、调节血小板功能和抗凝作用〔7〕。川芎嗪对晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）诱导的人视网膜色素上皮细胞产生VEGF具有抑制作用；可通过抑制DNA合成来抑制成纤维细胞的增殖〔4〕。玻璃体腔内注入川芎嗪能抑制眼内纤维增生，对防治增生性玻璃体视网膜病变（proliferativevitreoretinopathy，PVR）有效〔8〕。

穴位注射是传统针灸疗法与现代注射、封闭方法相结合的产物，是一种中西医结合的有效而无副作用的治疗方法。川芎嗪穴位注射能降低实验性高眼压兔的眼压，保护和修复高眼压下视网膜组织结构的损伤〔9〕。双侧针刺糖尿病视网膜病变大鼠睛明、太阳等穴，可以使大鼠微血管病变得到显著改善〔10〕。太阳穴位于颞浅动脉旁，颞浅动脉旁注射复方樟柳碱治疗缺血性眼底病已在临床上得到广泛应用〔11-12〕，其机制是通过颞浅动脉旁的自主神经末梢使脉络膜血管活性物质维持正常水平，恢复脉络膜血管正常舒缩功能，增加眼血流量，还有助于促进侧支循环建立，从而减轻脉络膜缺血导致的视神经、视网膜缺血。提示太阳穴药物注射对于改善眼部供血具有一定作用。

从本实验结果可以看到，应用川芎嗪后，穴位注射组与静脉注药组小鼠血清VEGF含量及视网膜新生血管细胞核数目均明显低于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。这一结果说明川芎嗪对视网膜新生血管增殖具有抑制作用，同时也说明了视网膜新生血管芽的减少与血清VEGF含量的降低有关，与李景恒的研究结果一致〔13〕。川芎嗪穴位注射与静脉给药比较，小鼠血清VEGF含量、视网膜新生血管芽数目差异无统计学意义（P＞0.05），表明川芎嗪穴位注射与静脉给药疗效相当。穴位注射安全有效、简便实用，为治疗血管源性眼病开辟了新的途径。

视网膜新生血管的发生和发展是一个极为复杂的过程，除VEGF以外，还可能涉及多条通路和多种细胞因子，尚有待于进一步研究。另一方面，目前中药治疗视网膜新生血管增殖尚处于初期研究阶段，有关其他给药方式以及中药眼科用药新剂型的开发等，也均具有很好的研究和应用前景。

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