人肠道菌对黄芩苷的生物转化

刘伶文，司 磊，任树勇，刘永红

西安工程大学西安710048

人肠道菌对黄芩苷的生物转化

刘伶文*，司 磊，任树勇，刘永红

西安工程大学西安710048

本研究利用体外培养人体肠道菌转化黄芩苷，探索转化方法及模型;用醇沉法提取了黄芩苷转化酶，即β-D-葡萄糖醛酸苷酶，并探讨了酶促影响因素;通过高效液相色谱检测产物黄芩素。经实验确定，黄芩苷转化培养液经超声波处理后，在转化液中有黄芩素检出。实验得知，转化酶为胞内酶，该酶的最适反应温度为55℃，最适pH为6.0，Ca2+、Mg2+和Cu2+对酶促反应具有促进作用，而Fe2+则具有抑制作用，Zn2+浓度在l mmol/L时起促进作用，在5 mmol/L时起抑制作用。

肠道菌;生物转化;黄芩苷;超声波处理;β-D-葡萄糖醛酸苷酶

绝大多数中草药以口服为主，药物中的有效成分在进入肠道之后与肠道菌群接触，大多数要经相应肠道菌代谢转化后被吸收。许多糖苷类药物在肠道内吸收很差，要经肠道菌水解为相应的苷元才可被吸收［1］。

黄芩为一著名中药，主要成分为黄芩苷(baicalin)，其次为黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用［2］。黄芩苷为一分子葡萄糖醛酸的黄酮衍生物，水解后为苷元黄芩素和葡萄糖醛酸。黄芩苷在肠道内难以被直接吸收，转化为黄芩素才能被吸收入血液而发挥作用［3］。同时大量临床药效实验证明，黄芩素的药理作用强于黄芩苷［3］。

黄芩素的制备方法有两种:一种是从中药黄芩中分离提取;另一种是水解黄芩苷制备黄芩素。在黄芩中，黄芩苷含量是黄芩素的数十倍［4］，从黄芩中直接提取黄芩素回收率很低。车庆明［5］采用混合酸与黄芩苷混合加热回流来制备黄芩素，能源消耗大，且严重污染环境。采用生物转化法生产黄芩素反应温和，易于控制，且无环境污染，汪红［6］成功采用丝状真菌—黑曲霉培养转化黄芩苷为黄芩素。目前用人肠道菌转化黄芩苷的研究还未见报道，本研究采用人体肠道菌体外培养转化黄芩苷，建立转化模型，为生物转化黄芩苷制备黄芩素提供了一个新的途径。

1 材料和仪器

1.1 实验材料

黄芩苷，西安小草植物科技有限公司;黄芩素标准品，陕西省食品药品检验所;硫乙醇酸盐培养基，陕西省食品药品检验所;维生素C，西安利君制药有限责任公司;超纯水，其他试剂为色谱纯。

1.2 仪器

高效 液 相 色 谱 仪 (AgilentTechnoLogies-1200series);SK5200LH超声波仪(上海科导超声仪器有限公司);超净工作台(苏州净化设备有限公司);高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R); HZQ-F160全温振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);752N紫外可见分光光度仪(上海精科实业有限公司)。三洋低温冰箱 MDFU5411—40℃(日本三洋)。HV-50高压灭菌气锅(浙江科通仪器有限公司)

2 实验内容

2.1 黄芩苷转化方法及模型

2.1.1 人肠道菌培养转化黄芩苷

称取4.2 g硫乙醇酸盐培养基，加水150 mL配制成液体培养基，加入黄芩苷5 g，煮沸后高压灭菌，冷却致室温后加入2 g维生素C，配制成黄芩苷转化培养基。人肠道菌群混合液制备参照文献［7］:取健康人的新鲜粪便2 g，立即加入150 mL培养基中，充分搅拌后用3层纱布过滤，将滤液分装于培养管中，采用套管法37℃恒温振荡培养72 hr。

2.1.2 超声破碎处理方法

超声波处理可能提高黄芩苷的分散度和溶解性，有利于被转化酶转化，也可能有破碎细菌细胞壁的作用，使细胞内的转化酶释放到胞外环境中，有利于黄芩苷的转化。设计不同的超声波处理方法，确定在人肠道菌体外培养转化黄芩苷模型中合理的超声波处理方法，以明确超声波处理在此模型中的作用。设定超声波频率为40 KHz，处理时间为20 min，实验设计见表1。

表1 超声波处理方法设计Table 1 Design of ultrasonic treatment

将处理结束的黄芩苷转化培养液于10 000 rpm下离心10 min，取上清液浓缩，然后用30 mL甲醇溶解，再次离心后取上清液待检测。

2.1.3 代谢产物高效液相色谱检测

分别取黄芩素标准品甲醇溶液(20 μg/mL)、各组样品上清液，用高效液相色谱仪(Agilent TechnoL-ogies-1200series)进行检测。色谱条件:流动相，甲醇∶水∶乙酸=65∶35∶0.2;波长，275 nm;流速，1.0 mL/min，柱温，28℃，进样量10 μL［8］。

2.2 黄芩苷转化酶的酶学性质

2.2.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的提取

培养液经40 KHz超声波破碎处理40 min［9］，4℃、10 000 rpm离心20 min，取上清液为粗酶液，于4℃冰箱保存。取10 mL粗酶液，加入1.5倍体积的-25℃乙醇，再次冷冻离心，取沉淀物溶于pH 6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，低温保存，为待测酶液。

2.2.2 酶活力的测定

酶活力的测定，可选用测定转化液中黄芩苷的水解产物黄芩素含量的方法。黄芩素的测定选用紫外吸光光度法。黄芩素结构中A环上有5，6，7三羟基结构，在紫外光区279 nm处有最大吸收，可通过测定酶促反应后转化液中黄芩素的含量来表示β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性。

2.2.2.1 黄芩素紫外吸收标准曲线

以甲醇为溶剂，配制3.0 mg/mL的黄芩素标准品溶液，分别稀释到40、50、60、80、100、125、160和200倍，将稀释倍数换算为具体浓度，然后利用紫外分光光度计在279 nm处检测其吸光度A值，以吸光度对溶液浓度作黄芩素的标准曲线。

2.2.2.2 酶活力的测定方法

取0.15 mol/L黄芩苷溶液0.5 mL和0.5 mL酶液，加入含1 mL pH 6.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的试管中。将试管置于50℃恒温水浴中反应30 min。反应结束后，向反应体系中加入1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL终止反应，加入5 mL甲醇，微型漩涡混合仪混匀，在转速10 000 rpm下离心时间10 min，离心结束后，取上清液用甲醇稀释500倍备用。

以溶剂甲醇为空白参照，测定离心上清液中黄芩素的吸光度A值，根据黄芩素标准曲线，计算上清液中黄芩素的含量。以实验条件下每分钟释放出1 μmol黄芩素所需要的酶量为1U。

2.2.3 酶促反应影响因素测定

测定反应温度、pH值、金属离子对酶促反应的影响，通过测定反应体系中酶活力的方法研究黄芩苷β-D-葡萄糖醛酸苷酶的酶学特性。

2.2.3.1 反应温度对酶促反应的影响:分别在25、30、35、40、45、50、55、60、65℃条件下测定酶活力，根据其酶活力的大小确定其酶的最适水解温度。

2.2.3.2 pH对酶促反应的影响∶配制一系列磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。测定不同pH下样品的酶活力，根据其酶活力的大小确定酶的最适水解pH。

2.2.3.3 金属离子对酶促反应的影响:实验研究Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+和 Zn2+对 β-D-葡萄糖醛酸苷酶活性的影响。分别配制1 mmol/L和5 mmol/L的CaCl2、MgSO4、CuSO4、FeSO4和ZnSO4金属盐溶液，初步定性分析金属离子对β-D-葡萄糖醛酸苷酶活性的影响。

3 结果分析

3.1 黄芩苷转化方法实验结果

黄芩素标准品、各实验组的液相色谱图分别见图1、图2、图3和图4。

由图1可见黄芩素标准品主峰，其保留时间为14.1 min。图2、3在此处无吸收峰，说明实验培养液中未检测出黄芩素。图4在此处出现吸收峰，说明实验转化液中检测到黄芩素。

A组实验经过肠道菌培养转化黄芩苷，未进行任何形式的超声处理，无法收获转化物黄芩素。

B组实验在接种前对含有黄芩苷的培养基进行超声处理，旨在提高黄芩苷的分散度和溶解性，以利于黄芩苷被肠道细菌细胞吸收及转化，提高转化酶的转化效率。但在转化液中未检测出黄芩素，说明在细菌胞外环境未发生黄芩苷的转化，转化可能发生在细胞内。这种超声波处理的方法不能收获黄芩苷。

C组实验方法，肠道菌在黄芩苷转化培养基中培养结束后，经超声波处理，在转化液中有黄芩素检出，说明此种方法的处理可以提取到黄芩素。超声波处理一方面可提高黄芩苷的分散度和溶解性，有利于被转化酶转化。更重要的是超声波处理有破碎细菌细胞壁的作用，使细胞内的转化酶释放到胞外环境中，同时也使胞内发生转化的黄芩素被释放，可以从转化液中获取黄芩素。这种超声波处理方法有利于黄芩苷的转化和黄芩素的提取。从以上实验结果比较也可以得出，黄芩苷转化酶为胞内酶。

3.2 黄芩苷转化酶的酶学性质

3.2.1 反应温度对酶促反应的影响

实验设定酶促反应溶液的pH值为6.5、其他条件不变时，只改变酶促反应的温度，测定不同温度下β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性，结果见图5。

图5 反应温度对酶活力的影响Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity

由图5可知，当温度由25℃上升到55℃时，酶活力逐渐升高。温度达到55℃，酶活力达到最高，继续升高温度，酶活力开始下降，当温度升高到60℃时，酶活力急速下降。温度升到70℃时，几乎无法测出酶活，断定蛋白质发生变性，酶已基本失活。实验测定β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力最适温度为55℃。

3.2.2 pH值对酶促反应的影响

设定酶促反应温度为55℃，其他条件不变，仅改变反应的pH值，测定不同pH值对酶活力的影响，见图6所示。

由图6可见，反应环境pH由3.5上升到5.5时，酶活力逐渐升高。pH达5.5时，酶活力达到最高，继续升高pH，酶活力逐渐下降。测得的β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力最适pH值为5.5。

3.2.3 金属离子对酶促反应的影响

图7 金属离子对酶活力的影响Fig.7 Effect of metal ions on enzyme activity

设定环境反应温度55℃，反应pH值为5.5，其他条件不变，以不含待测离子的β-D-葡萄糖醛酸苷酶的水解活性为100%，测定值与之相比较，得相对值，结果如图7所示。图中黑色图柱为离子浓度1 mmol/L时酶活力，白色图柱为离子浓度5 mmol/L是酶活力。斜线柱为未加金属离子的空白对照。

由图7可知，Ca2+、Mg2+和Cu2+对酶促反应具有促进作用，可作为酶促反应的激活剂;而Fe2+则具有抑制作用，可作为酶促反应的抑制剂;Zn2+在低浓度下起促进作用，在高浓度时起抑制作用。

4 结论

本研究建立了体外培养人肠道菌转化黄芩苷的实验模型，为生物转化黄芩苷制备黄芩素提供了新的途径和理论支持

研究表明黄芩苷经人肠道菌作用转化为苷元黄芩素。对黄芩苷生物培养液进行超声波破碎处理，转化酶释放后，促使黄芩苷转化和利于提取黄芩素。

黄芩苷转化过程中起转化作用的是黄芩苷-β-D-葡萄糖醛酸苷酶，该酶的最适反应温度为55℃，最适pH值为6.0，金属离子Ca2+、Mg2+和Cu2+对酶促反应具有促进作用，而Fe2+则具有抑制作用，Zn2+在低浓度下起促进作用，高浓度时起抑制作用。实验中用紫外分光光度法测定转化液中黄芩素的含量来表示β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性。

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4 Fu H(符洪)，Xiao XY(肖新月)，et al.Determination and Chromatogram Recognition of Main Chemical Constituents in Radix Scutellariae of Different Resource.ChinJ Pharm Anal (药物分析杂志)，2003，13:33-39.

5 Che QM(车庆明).A new preparation of baicalein(一种制备黄芩素的方法).CN02129372.4，2003，02:26.

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8 Nie X(聂鑫)，Luo JB(罗佳波)，et al.HPLC quantitative analysis of four flavonoids in crude baicalin.Chin Hosp Pharm J(中国医院药学杂志)，2007，27:191-193.

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Biotransformation of Bacicalin by Human Intestinal Bacteria

LIU Ling-wen*，SI Lei，REN Shu-yong，LIU Yong-hong
Xi'an Polytechnic University，Xi’an 710048，China

The characteristic of human intestinal bacteria biotransformation system was studied.The enzyme(β-D-glucuronidase)was isolated by Alcohol precipitation，and the factors on enzymatic properties were analyzed.The product was identified as baicalein by high performance liquid chromatography(HPLC).After ultrasonic treatment on cultivation medium，the baicalein could be extracted.At pH 6.0 and 55℃，the activity of β-D-glucuronidase reached maximum，and was activated by Ca2+、Mg2+and Cu2+，but inhibited by Fe2+;at l mmol/L Zn2+played a catalytic role，but an inhibitory factor at 5 mmol/L.

intestinal bacteria;biotransformation;baicalin;ultrasonic treatment;β-D-glucuronidase

1001-6880(2012)10-1437-05

2012-02-22 接受日期:2012-05-24

陕西省教育厅专项科研项目(09JK453);陕西省科技厅工业攻关项目(2008k07-14)

*通讯作者 Tel:86-013310988359;Email:LingwenLiu1@sina.com

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