重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1，Re-4+Re-5)免疫肉鸽效果试验

栗 新，胡祖余，王举勇，占松鹤

(1.安徽省六安市裕安区动物疫情测报站，安徽六安 237000;2.安徽省动物疫病预防与控制中心，合肥 230000)

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1，Re-4+Re-5)是用于预防由H5亚型禽流感病毒引起的禽流感，在我国受变异毒株威胁区的种鸡、蛋鸡使用普遍[1]，水禽免疫也有记载[2-3]，但在预防肉鸽禽流感方面未见报道。为了解该种禽流感疫苗不同剂量对肉鸽的免疫效果以及探讨免疫程序，从而指导肉鸽养殖场合理使用禽流感疫苗，本研究开展了免疫肉鸽效果试验。

1 试验材料

1.1 禽流感疫苗 重组禽流感H5亚型二价灭活疫苗 (H5N1，Re-4+Re-5)批号为011161，由肇庆大华农生物药品有限公司提供。

1.2 试验动物 试验动物为人工饲养的美国王鸽，从安徽省裕安区选取2个规模饲养场(Ⅰ场、Ⅱ场)开展试验。Ⅰ场存栏肉鸽4660只，其中1月龄以上肉鸽3700只;Ⅱ场存栏肉鸽5720只，其中1月龄以上肉鸽4250只。所有试验鸽均未接种过禽流感疫苗。

1.3 诊断试剂 H5(Re-4)诊断抗原(批号201101)和阳性血清(批号201101)、H5(Re-5)诊断抗原(批号201102)和阳性血清(批号201003)，均购于哈尔滨维科生物技术开发公司。

2 试验方法

2.1 试验前准备 接种疫苗前一周内，对实验场地环境进行消毒。同时采集肉鸽肛拭子10份，进行H5亚型病原学检测，采集40份血样进行禽流感H5(Re-4)、H5(Re-5)亚型抗体检测。

2.2 试验分组 每场随机选择1月龄以上肉鸽320只，均分8个组，进行隔离试验，其中7个组分别注射 0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 试验疫苗，另外1组作空白试验对照。

2.3 免疫接种 使用连续注射器，采用胸部肌肉注射方法接种疫苗，并给试验肉鸽打上脚环，做好记录。

2.4 二次免疫 选择注射0.2、0.3、0.4、0.5 mL疫苗试验组肉鸽，在第一次免疫后第3周，将已免肉鸽半数进行第二次免疫，免疫剂量、疫苗类型与首次免疫一致。1.0、1.5、2.0 mL试验疫苗组不进行第二次免疫。

2.5 样品采集 第一次免疫后2周开始采血，以后每周采血一次，每次每组随机采血5份，连续采血8周。每只鸽翅膀下静脉采血2 mL，分离血清，冷冻保存备检。

2.6 抗体监测 按《中华人民共和国国家标准——高致病性禽流感诊断技术》(GB/T18936-2003)规定的操作规范进行血凝和血凝抑制试验，检测H5亚型(Re-4、Re-5)禽流感抗体效价，判定检测结果，每组求取抗体效价平均值，绘制折线图[4]。

3 结果与分析

3.1 免疫前抗体检测 H5亚型病原学检测阴性(委托安徽省动物疫控中心实验室检测)，H5亚型(Re-4)、(Re-5)抗体检测为阴性，空白对照组抗体检测一直呈阴性。

3.2 不同剂量禽流感疫苗初次免疫抗体消长规律

H5(Re-4)抗体:由图1可见，注射剂量大，抗体产生滴度高、峰值早、维持时间长、下降幅度小。0.2、0.3 mL组免后3周达有效保护水平，第5周达到峰值，能维持5余周;0.4、0.5 mL组免后第2周达有效保护水平，第4～5周达到峰值，能维持7余周;1.0、1.5、2.0 mL 组免后第2周达8 ～9 log2，第4周达到峰值，第9周下降到6.5 log2。

图1 禽流感二价苗免疫一次肉鸽(Re-4)抗体变化水平

H5(Re-5)抗体:由图2可见，注射剂量大，抗体产生滴度高、维持时间长、下降幅度小。0.2、0.3 mL组免后第3周达有效保护水平，第4周达到峰值，只能维持3～4周;0.4、0.5 mL组免后第2周达到有效保护水平，第4～5周达到峰值，能维持7余周;1.0、1.5、2.0 mL组免后第2周达6 log2以上，第4周达到峰值，第9周下降到6 log2左右。

图2 禽流感二价苗初次免疫肉鸽(Re-5)抗体变化水平

3.3 不同剂量禽流感疫苗第二次免疫抗体消长规律 H5(Re-4)抗体:由图3可见，H5第二次免疫后第1周，各组Re-4抗体测定值在6.5～9.5 log2之间，第2周达到峰值7～10 log2，整体高于同期初次免疫，且抗体水平曲线上下起伏不大，预计经过二次免疫肉鸽，到初次免疫后第12周，抗体滴度仍能达到保护水平。

H5第二次免疫Re-5抗体:由图4可见，H5第二次免疫后第1周，各组Re-5抗体测定值在7～8 log2之间，第2周达到峰值7.2～9.3 log2，整体高于同期初次免疫，且抗体水平曲线上下起伏不大，预计经过二次免疫肉鸽，到初次免疫后第12周，抗体滴度也能达到保护水平。

图3 禽流感二价苗第二次免疫肉鸽(Re-4)抗体变化水平

图4 禽流感二价苗第二次免疫肉鸽(Re-5)抗体变化水平

4 小结

本试验证实了H5(Re-4+Re-5)亚型禽流感灭活疫苗免疫肉鸽的有效性，初次免疫的Re-4比Re-5抗体形成效果好，相对高出1个抗体滴度，且二者都是注射剂量大，抗体产生滴度高、维持时间长、下降幅度小。第二次免疫效果二者相近，都比初次免疫整体效果好，0.2、0.3 mL低剂量接种组初次免疫抗体形成效果不太理想，但加强免疫后抗体水平迅速上升，第二次免疫后2周达到峰值，而且下降缓慢，预计到初次免疫后第12周，抗体滴度也能达到保护水平。

最佳免疫剂量:选免一次，H5(Re-4)和H5(Re-5)都是至少注射疫苗0.4 mL;选免二次，H5(Re-4)、H5(Re-5)同剂量第二次免疫至少注射疫苗0.3 mL。

推荐免疫程序:鉴于肉鸽生性敏感，应激反应强，但天生免疫能力就好等生物学习性[5]，结合本试验数据，对1月龄内出栏的商品肉鸽可不免或选免一次，1～2周龄每只接种0.4 mL。对1～6月龄青年肉鸽，可选免二次，一种是1～2周龄首免，4周龄进行第二次免疫;另一种是4周龄首免，6周龄进行第二次免疫，每只每次都是接种0.3 mL。对选育的种鸽，在6月龄开产前2周进行三免，每只接种0.3 mL，以后相同剂量每半年免疫一次[6-7]。

[1]农业部农医发〔2012〕1号.2012年国家动物疫病强制免疫计划[S].

[2]陈桂英.鸭免疫重组禽流感病毒H5亚型二价灭活苗(H5N1，Re-5+Re-4)后抗体水平分析[J].中国兽医杂志，2011，47(7):27-28.

[3]陈永忠，李俊平，李启红，等.重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1，Re-5+Re-4)免疫鸡和鸭后抗体消长规律[J].中国兽医杂志，2010，46(5):20-21.

[4]GB/T18936-2003，高致病性禽流感诊断技术[S].

[5]李绶章.肉鸽鹌鹑饲料科学配制与应用[M].北京:金盾出版社，2008:17-18.

[6]陈坤永，翁良树，张祥解，等.种鸽免疫禽流感疫苗HI抗体水平消长规律的调研[J].养禽与禽病防治，2004，(7):12-13.

[7]周锦萍，刘佩红，刘康明，等.重组H5N1亚型禽流感灭活苗对鸽免疫程序的初步研究「J」.中国兽医杂志，2008，44(7):38-3009.