新城疫浓缩灭活疫苗的初步研究

李俊平，李启红，杨承槐，刘 丹，李慧姣，蒋桃珍，黄建华

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒引起的一种侵害禽类的急性高度接触性传染病，是造成我国养鸡业重大经济损失的主要病原之一。疫苗免疫是预防该病的有效手段，目前在我国注册用于生产ND活疫苗的毒株有低毒力毒株HB1株、La Sota株、Clone30株、VG/GA株、V4/HB92克隆株，灭活疫苗毒株主要是La Sota株。符合质量标准的ND疫苗免疫鸡后，可以有效保护ND强毒株的攻击。近年来，虽然可见有关NDV基因型的变化及不同基因型致病性差异的报道[1-5]，但尚无可靠的试验数据证明现有疫苗免疫无法保护某一基因型NDV的攻击。

常规鸡ND灭活疫苗在生长周期较短的肉用鸡中被广泛使用，这对控制肉鸡ND疫病发挥了重要作用。但由于常规疫苗使用剂量大，注射部位易出现较重的局部炎症反应或肉鸡屠宰时仍有疫苗未能完全吸收，这不仅影响鸡肉的品质，同时因为疫苗用佐剂为体内不可代谢的矿物油，也存在着一定的食品安全隐患。为解决这一问题，本研究对现有灭活疫苗制造规程进行量化并研究了不同浓缩倍数疫苗的免疫效力，初步优化了新城疫浓缩灭活疫苗的最佳生产工艺。该生产工艺不仅大大减少了疫苗的使用剂量，同时疫苗的免疫效力也相应提高，有望为肉鸡新城疫的有效控制和食品安全提供保障。

1 材料和方法

1.1 病毒株 鸡新城疫病毒(La Sota株)，病毒含量为108.5EID50/0.1mL。

1.2 SPF鸡胚及SPF鸡 由北京实验动物中心提供，SPF种蛋孵至9～11日龄备用。

1.3 ND抗原增殖条件的优化 选用10日龄非免疫鸡胚，设定3个滴度(103.0、104.0和105.0EID50/0.1 mL)的NDV病毒含量用于接种，每个剂量接种非免疫鸡胚130～140枚，每胚0.1 mL，接种后不同时间分别收获死亡和存活的鸡胚。测定收获抗原的EID50、HA和总蛋白。同时设不接毒组作为对照，收获尿囊液作HA和总蛋白含量测定。

1.4 抗原浓缩 根据1.3项试验结果确定的ND抗原增殖条件，制备ND抗原。抗原经离心去沉淀后，采用Millipore公司生产的截留分子量为100 kD的浓缩滤膜对ND抗原进行浓缩，分别浓缩至总体积的 1/2、1/3、1/4、1/10，测定浓缩液和滤过液中抗原的EID50、HA和总蛋白。

1.5 不同浓缩倍数疫苗的免疫效力研究 用10倍浓缩的抗原加PBS配制成了原倍抗原、3倍抗原、5倍抗原和10倍抗原，分别以水相∶油相=1∶2乳化制备4批疫苗。每批疫苗经胸部肌肉注射接种4周龄的SPF 鸡10 只，14、21、28、35 d 采血测定HI效价。

2 试验结果

2.1 ND抗原的增殖条件 分别以103.0EID50、104.0EID50和105.0EID50病毒含量接种10日龄非免疫鸡胚，结果表明，随着培养时间的增加，鸡胚死亡增多，且死亡数量随接种剂量的增大而增多(表1)。测定收获抗原的EID50、HA和总蛋白，结果见表2。结果表明103.0EID50和104.0EID50接种组收获的病毒含量和HA效价较105.0EID50接种组高;抗原中总蛋白含量随培养时间的增加而增高，但总蛋白含量与病毒含量及HA效价无明显的相关性，同期收获尿囊液中接毒组总蛋白含量低于对照组，可见通过测定总蛋白含量无法可靠衡量抗原含量。

由试验结果可确定ND抗原的增殖条件如下:选用10日龄发育良好的非免疫鸡胚，每胚经尿囊腔接种0.1 mL(含103.0～104.0EID50)的病毒液。弃60 h内死亡鸡胚，此后，每4～6 h照蛋1次，随时取出死亡鸡胚，直至96 h，不论死亡与否，全部取出，置于2～8℃冷却4～24 h，无菌收获尿囊液。

表1 不同接种剂量鸡胚死亡情况

表2 不同接种剂量和收获时间对收获抗原的影响

续表

2.2 抗原浓缩 根据ND抗原增殖条件的优化试验结果，制备了约10000 mL的ND抗原，病毒含量为108.5EID50/0.1mL，HA效价为210。将制备的ND 抗原分别浓缩至总体积 1/2、1/3、1/4、1/10，测定浓缩液和滤过液中抗原的EID50、HA和总蛋白，结果见表3。结果表明，100 kD滤膜能有效截留NDV，浓缩倍数与HA效价及病毒含量成正相关;滤过液中含有部分具有感染性的病毒，但测不到血凝价。收获的尿囊液中总蛋白浓度与浓缩倍数相关性不强。因此可采用HA效价作为浓缩抗原的质量评价标准。

表3 ND浓缩抗原的HA效价和病毒滴度

2.3 不同浓缩倍数疫苗的免疫效力 原倍抗原、3倍抗原、5倍抗原和10倍抗原，以水相∶油相=1∶2乳化制备4批疫苗，分别为 ND01、ND03、ND05和ND10。免疫试验结果表明，免疫鸡的HI抗体效价基本与抗原浓缩倍数成正相关，但当HA效价达到一定水平后，免疫鸡的HI抗体滴度即保持一定水平而无明显升高。采用3倍浓缩抗原制备的疫苗，以5 μL的剂量(标准检验剂量的1/4)免疫SPF鸡，即可达到合格的抗体效价，并且免疫后35 d效价依然在较高水平，详细结果见表4。

3 讨论与小结

3.1 ND抗原繁殖时接毒剂量的优化 《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)(简称规程)[6]中鸡新城疫灭活疫苗制造与检验规程中有关ND抗原制备的接种方法为:取生产用种毒，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4或10-5)，每胚尿囊内接种0.1 mL。规程中对接毒的病毒含量未做具体要求，对生产者指导性不强。本研究结果表明每胚经尿囊腔接种 0.1 mL(含 103.0～104.0EID50)的病毒液收获的尿囊液病毒含量高，从而对现有规程中鸡新城疫灭活疫苗制造及检验规程的接毒剂量进行了量化，对ND抗原的生产更具有指导意义。

表4 不同浓缩倍数疫苗免疫后的HI抗体效价

3.2 ND病毒的浓缩工艺 病毒浓缩是增加疫苗抗原浓度，降低副反应，提高免疫效果的有效手段，已在我国兽用疫苗生产中广泛应用，尤其是生产多联灭活疫苗时，需对各抗原成分进行适当浓缩[7]。有关禽用疫苗病毒浓缩技术研究，新城疫病毒浓缩工艺研究已有报道[8-9]，但采用的浓缩系统不同，实验结果有所差别。本研究在参考文献报道的基础上，小试时选用了3种不同孔径的滤膜，结果100 kD滤膜能有效截留NDV，50 kD滤膜可有效截留NDV，但滤过效率低，而300 kD滤膜无法有效截留NDV，所以选用100 kD滤膜浓缩ND抗原。在对浓缩效果评价指标方面，病毒含量(EID50)及蛋白含量虽然随浓缩倍数的提高而增加，但缺乏良好的线性关系，而且测定周期相对较长，无法及时准确评价浓缩效果;HA效价与浓缩倍数具有良好的正比线性关系，测定简单，用时少，能够及时准确评价浓缩效果，是确定浓缩效果的可靠指标。

3.3 ND病毒抗原浓缩倍数与免疫效果 3倍浓缩的ND抗原制备的疫苗，以1/4倍效力检验用剂量(5 μL)免疫SPF鸡，按现有ND灭活疫苗的质量标准进行效力检验，能够达到标准要求，而且抗体在较高水平可以维持5周以上。因此，以ND病毒3倍浓缩的抗原制备的灭活疫苗，小剂量(0.1 mL)免疫1日龄肉鸡，有望为饲养周期短的肉鸡提供有效的保护。采用该生产工艺研制肉鸡专用ND灭活疫苗，不仅能大大减少疫苗的使用剂量，同时疫苗的免疫效力也会相应提高，为肉鸡ND的有效控制和食品安全提供保障。

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