复方煤焦油酸溶液对口蹄疫病毒杀灭效果试验

刘 澜，张俊儒，张 强，莫 云，杜继红，张 雁，文 波，5，杨秀玉

(1.北京大北农动物保健技术研究中心，北京 101407;2.中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州 730050;3.北京市兽药监察所，北京 100107;4.北京市朝阳区种植业养殖业服务中心，北京 100018;5.韶山大北农动物药业有限公司，湖南韶山 411300;6.中国兽医药品监察所，北京 100081)

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄类动物共患的急性、热性、接触性传染病，也是人畜共患的传染病。可引起幼畜死亡、产奶量下降、肉品质下降、动物的生产性能降低，造成巨大的经济损失，全世界每年由此造成的直接经济损失可达数百亿美元[1]。国际兽医局(OIE)将其列为A类动物疫病的第一位，我国也将其列为一类动物疫病之首。在自然状态下FMDV可经消化道感染，经呼吸道感染是最主要的传播途径，动物、人员及运输工具等均可机械性地散播病毒[2]。一旦发现疫情，彻底、科学的消毒是控制疫情传播的最好方法。复方煤焦油酸溶液主要成分为高沸点煤焦油酸、烷基苯磺酸及醋酸等，具有高效、超强广谱、超级稳定等优点[3]。目前已在世界范围内广泛用于口蹄疫、禽流感等烈性传染病的控制。本文通过试验考察复方煤焦油酸溶液对口蹄疫病毒的杀灭效果，为其临床应用提供科学的指导。

1 材料与方法

1.1 材料 消毒剂:韶山大北农动物药业有限公司生产的复方煤焦油酸溶液，批号11030701;对照药物，国外某公司生产的复方煤焦油酸溶液，批号1011LA0043;O型口蹄疫病毒ELISA检测试剂盒，由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室提供;实验动物:4日龄吮乳乳鼠(清洁级昆明小鼠)，由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物场提供。

病毒的制备和稀释:O型口蹄疫乳鼠组织毒(LD50=1×10-8.0，由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室提供)，用0.04 mol/L磷酸盐缓冲液稀释成1∶500倍病毒悬液，4℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 安全性试验 安全性试验由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室进行。将复方煤焦油酸溶液用去离子水分别做1∶100、1∶200、1 ∶300、1 ∶400、1 ∶500、1 ∶600 倍稀释，然后分组皮下注射4日龄乳鼠，每只乳鼠注射0.2 mL复方煤焦油酸溶液稀释液，每组注射5只，同时设阴性对照组，阴性对照组乳鼠每只注射0.2 mL去离子水。每组设置4个平行。注射后连续观察72 h，记录乳鼠发病死亡情况。另以对照药物替代复方煤焦油酸溶液，按上述方法进行试验。

1.2.2 杀灭口蹄疫病毒试验 杀灭口蹄疫病毒试验由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室进行。根据安全性试验结果，将复方煤焦油酸溶液用去离子水分别做1∶250、1∶300、1∶350、1∶400稀释，然后依次与1 ∶500倍稀释的 O型口蹄疫乳鼠组织毒等量混合，室温作用30 min后皮下注射4日龄乳鼠，每只乳鼠背部皮下注射0.2 mL消毒剂-病毒混合液，每组注射5只;同时设病毒对照组，每组4只乳鼠，每只乳鼠皮下注射0.2 mL 1∶1000倍稀释的病毒液;设健康对照组，健康对照每组2只，每只乳鼠皮下注射0.2 mL去离子水。每组设置5个平行。注射后连续观察7 d，记录情况。另以对照药物替代复方煤焦油酸溶液，按上述方法进行试验。

1.2.3 病毒抗原检测 将各组发病死亡乳鼠的胴体加0.04 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.6)研磨后制成1∶10(W/V)悬液，健康对照组在观察7 d后处死，同样将胴体研磨后制成1∶10(W/V)悬液，悬液放置4℃过夜，6000 r/min离心10 min，取上清液进行ELISA检测。ELISA检测方法:用包被缓冲液稀释FMDV O型兔血清至工作浓度(1∶200)，加入包被酶标板，置于4℃过夜;用PBS洗涤后加入试剂盒阳性对照和上述样品，置于37℃旋转振荡器中振荡50 min;再用PBS洗涤后加入1∶100稀释的FMDV O型豚鼠抗血清，封板后置于37℃旋转振荡器中振荡40 min;酶标板洗涤后加1∶400稀释的酶标抗体，37℃振荡孵育40 min;洗涤后加入邻苯二胺(OPD)溶液(含H2O2)，37℃避光振荡孵育15 min，加1.25 mol/L硫酸终止液，混匀后在492 nm下读取OD值。

1.3 评判标准 消毒剂安全性判定标准:乳鼠不死亡，判为安全，反之为不安全。消毒剂杀灭病毒效果判定标准:1)病毒对照组乳鼠在接种病毒后发病死亡，并从乳鼠体内检测到口蹄疫病毒增殖，且健康对照组试验期间无异常表现，全部健康活泼，视为试验成立;2)消毒剂试验组乳鼠在试验期间无异常表现，全部健康活泼，判定消毒剂该浓度下产品有效;3)消毒剂试验组有乳鼠死亡，并从乳鼠体内检测到口蹄疫病毒增殖，判定消毒剂该浓度下产品无效。

2 结果与分析

2.1 安全性试验结果 消毒剂对乳鼠的安全性试验发现，复方煤焦油酸溶液和对照药物在1∶100～1∶400倍稀释下接种乳鼠均有死亡，在1∶500和1∶600倍稀释下均未见接种乳鼠死亡，阴性对照未发现接种乳鼠死亡。表明1∶500倍以上稀释浓度的复方煤焦油酸溶液和对照药物皮下注射乳鼠不会产生致死反应，乳鼠安全。安全性试验结果如表1、表2所示。

表1 复方煤焦油酸溶液对动物的安全性测定结果

表2 对照药物安全性测定结果

2.2 杀灭口蹄疫病毒试验结果 根据安全性试验结果，对杀灭口蹄疫病毒试验的消毒剂浓度设置为1 ∶500、1 ∶600、1 ∶700、1 ∶800 倍稀释，同时设置阳性对照和健康对照。试验结果发现，复方煤焦油酸溶液和对照药物在1∶500和1∶600倍稀释下，接种乳鼠均未死亡，全部健康活泼;而在1∶700和1∶800倍稀释下，接种乳鼠均有死亡，且1∶800倍稀释较1∶700倍稀释死亡乳鼠显著增加。表明1∶500和1∶600倍稀释浓度的复方煤焦油酸溶液和对照药物可能灭活了O型口蹄疫乳鼠组织毒，而1∶700和1∶800倍稀释浓度的复方煤焦油酸溶液和对照药物可能没有有效灭活O型口蹄疫乳鼠组织毒，导致部分乳鼠感染FMD而死亡。复方煤焦油酸溶液和对照药物对口蹄疫病毒的杀灭效果试验结果如表3、表4所示。

表3 复方煤焦油酸溶液杀灭口蹄疫病毒试验结果

表4 对照药物杀灭口蹄疫病毒试验结果

2.3 病毒ELISA检测结果 在对FMD病毒ELISA检测中，攻毒用1∶500倍稀释的O型口蹄疫乳鼠组织毒OD值为0.306;健康对照组样品的平均OD值为0.008，表明健康对照组乳鼠未感染FMD病毒;阳性对照组的平均OD值为1.600，表明阳性对照组乳鼠均感染FMD病毒，且病毒在乳鼠体内大量增殖。实验各组中死亡乳鼠样品的OD值详见表5，经SPSS 13.0统计分析，复方煤焦油酸溶液1∶700、1 ∶800 及对照药物 1 ∶700、1 ∶800 的OD值与1∶500倍稀释的乳鼠组织毒OD值差异极显著(P＜0.01)，表明实验中各死亡乳鼠被FMD病毒感染，且病毒在乳鼠体内大量增殖。

表5 FMD病毒ELISA检测结果

3 结论与讨论

口蹄疫病毒属小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，是一种无囊膜的病毒。国内外对其抵抗力的研究中，一般认为FMDV对环境中的不利因素有较强的抵抗力，在4℃比较稳定，低温条件下可长期存活，对热和干燥有一定的抵抗力，对酚类、醇类等消毒剂不敏感[4]。但FMDV对酸很敏感，通过调节pH值能达到灭活口蹄疫病毒的效果，在pH 6.5的缓冲溶液中，在4℃条件下14 h内，可灭活 90%;pH 5.5时，1 min灭活90%[5]。控制口蹄疫疫情的传统的消毒方法有10～20 g/L的氢氧化钠、10 mL/L的甲醛溶液、50～500 g/L的碳酸盐等浸泡或喷洒污染物，但这些消毒剂的腐蚀性和刺激性强[6-8]。

复方煤焦油酸溶液由高沸点煤焦油酸、烷基苯磺酸及醋酸等复方配制而成，具有低pH值(pH值在2.0～2.4之间)、超强的表面粘着和渗透性及生物安全等优点，目前已被世界各地广泛选择用于流行病的防控。在法国、英国、美国被政府指定为口蹄疫专用消毒剂，在韩国也被用于口蹄疫的控制，在泰国被用于禽流感的控制等。我国1999年版《进口兽药质量标准》规定复方煤焦油酸溶液用于畜禽舍及器具的消毒。由Antec International-A Dupont Company生产的复方煤焦油酸溶液(FarmFliud S)自20世纪进口到我国以来，被规模猪场推崇应用于动物栏舍及环境的消毒和口蹄疫疫情的防控。国内也出现众多的类似产品，但因其在工艺技术等方面千差万别，导致产品在消毒效力、安全性等方面也存在较大的差异。北京大北农动物保健技术研究中心和韶山大北农动物药业有限公司通过对复方煤焦油酸溶液配方及工艺技术等多方面的深入研究，攻克了复方煤焦油酸消毒剂制备技术难点，极大地提高了复方煤焦油酸消毒剂在消毒效力、安全性等方面特性。

上述试验表明，此煤焦油酸消毒剂1∶600倍稀释液在室温条件下与O型口蹄疫乳鼠组织毒作用30 min，能100%杀灭口蹄疫病毒，可用于口蹄疫病毒污染的动物栏舍、运载工具及环境等消毒，其消毒效力、安全性等方面与国外同类产品(对照药物)相当。

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