未孕和3个月孕龄的小尾寒羊子宫内膜β－防御素的表达研究

锡林高娃，李咏兰，弓 剑，吕桂芬，李传刚

（1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古 通辽028000；2.内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特010022）

防御素（defensins）是广泛分布于动物界和植物界的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物肽，是内源性抗微生物肽中的一个大家簇。在哺乳动物中表达的是α－防御素、β－防御素和θ－防御素［1］。β－防御素主要分布于哺乳动物黏膜上皮细胞内，被确认为黏膜表面抗微生物屏障的组成成分。在绵羊体内发现有两种β－防御素存在［3］。小尾寒羊起源于古代北方蒙古羊，经过长期选择和精心培育，小尾寒羊具有早熟、多胎、多羔、生长快、体格大、产肉多、裘皮好、遗传性稳定和适应性强等优点，在世界羊业品种中被国家定为名畜良种。关于小尾寒羊防御素的研究尚未见报道。本文应用实时荧光定量PCR技术，采用相对定量法，分析未孕和怀孕小尾寒羊子宫内膜组织内β－防御素mRNA的表达量，这为进一步研究动物生殖过程中的免疫防御机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 未孕和3个月孕龄的小尾寒羊子宫内膜（取自于呼和浩特市回民屠宰场）。屠宰后，立即刮取适量子宫内膜放入液氮中，放入－70℃冰箱保存，备用。

1.2 RNA的提取 使用凯基Trizol法快速提取RNA。A260／A280值确定纯度；1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性［4］。

1.3 反转录反应（reverse transcription）合成cDNA按SYBR ExScript RT－PCR Kit试剂盒说明书进行［5］。

1.4 β－防御素基因cDNA的实时荧光定量PCR根据GenBank中公布的羊的β－防御素（sBD－1、sBD－2）、（GBD－1、GBD－2）的cDNA 序列，利用计算机软件DNAStar（Lasergene5.01）进行基因序列的同源性比较，根据其保守区和引物设计原则设计一对PCR引物。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列为：

β－防御素基因

肌动蛋白基因

1.5 cDNA的实时定量PCR 利用反转录合成的cDNA同时进行目的基因（sBD）PCR和内标基因（β－Actin）实时定量PCR。依次加入SYBRpremis EXTaqTM10μL，cDNA模板2.0μL，上下游引物各0.5μL，灭菌蒸馏水10μL。扩增条件：95℃预变性2min；95℃变性30s；55℃～60℃退火30s；72℃延伸20s；读板，82℃温育5s，读板，40个循环；72℃延伸7min。70℃～95℃测定融解曲线。

以DNA Marker DL－2 000为标准，PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其分子量。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测定出sBD基因和β－Actin基因的Ct值［6］，则sBD基因的相对表达量为2－△CT。

2 结果与分析

2.1 荧光定量RT－PCR检测小尾寒子宫内膜儿sBD－2表达的电泳结果 提取小尾寒羊（3月龄孕龄）子宫内膜总RNA，PCR产物电泳分析见图1。片段大小与目的产物大小一致。为排除基因组污染对PCR体系造成的影响，设阴性对照（图1中1、4），在相同条件下不加反转录酶AMV，结果显示无扩增产物，说明该产物是以mRNA为模板扩增而来。

2.2 子宫内膜sBD基因PCR产物电泳检测及基因测序结果 取未孕和孕龄3个月子宫内膜组织经总RNA提取、反转录后进行实时荧光定量PCR，扩增产物进行电泳检测。结果见图2。

图2表明，小尾寒羊子宫内膜sBD基因扩增片段为303bp，β－Actin扩增片段为310bp，与设计扩增片段大小一致。

图1 荧光荧光定量PCR电泳结果

其cDNA序列输入GenBank数据库，采用BLASTN进行同源性分析，结果显示，小尾寒羊子宫内膜组织的sBD基因cDNA与文献Ovis aries sBD－2基因的cDNA间有99%的同源性（299／300）。

2.3 子宫内膜mRNA相对定量测定 对20例未孕和怀孕小尾寒羊子宫内膜mRNA进行相对定量测定，用2－△Ct表示子宫内膜mRNA相对表达量值。未孕和怀孕小尾寒羊子宫内膜mRNA的表达量分别为2－8.95和2－5.58。

图2 sBD、β－Actin基因PCR产物凝胶电泳

对上述PCR扩增产物进行测序，序列为：

GCCAGCATGAGGCTCCATCACCTGCTCCTCGTGCTTTTCTTCGTGGTCCTGTCTGCTGGG TCAGGATTTACTCATGGAGTAACAGATAGTCTAAGCTGCCGTTGGAAGAAAGGCATCTGTG TGCTGACCAGGTGCCCTGGAACCATGAGACAGATTGGCACCTGTTTCGGGCCCCCAGTAAAA TGCTGCAGACTGAAGTAACAGAAGGCGAAGACGCGGCCGGGACCGATGCGGAGTCAGAAAT GCTGCAGACTGAAGTAACAGAAGGCGAAGACGCGGCCGGGACCGATGCGGAGTCAGAA

3 讨论

已有学者通过Northern blot杂交进行了不同日龄羔羊β－防御素mRNA的检测，结果发现，从7日龄开始就有sBD－1的mRNA少量出现，在49日龄羔羊瘤胃内sBD－1的mRNA最丰富，以后又逐渐减少［7］。由此可见，β－防御素的表达不仅有组织特异性，而且与它的发育阶段有关。在α－防御素中也存在组织表达特异性和发育阶段表达特异性。1996年Mallow E B等研究出生前后胎儿、婴儿及成人小肠内 HD－5、HD－6的基因时发现 HD－5在13.5～17周间的小肠结肠的都有二者的表达，但到了17周时，HD－5仅在小肠中表达。还发现人小肠α－防御素HD－5和HD－6在胎儿、婴儿和成人肠道内的表达不同，即胎儿小肠内α－防御素的表达量比新生儿低，新生儿又比成年人低，同样在各个阶段HD－5的表达量比HD－6高［8］。由此揭示了防御素的表达与动物体接触的环境因素密切相关。同时，原位杂交方法研究24周龄胎儿的潘氏细胞中防御素mRNA表达情况比相应地成体中及出生婴儿中的潘氏细胞表达的要低，这正是未成熟的防御水平的特征。对蒙古绵羊发育过程中β－防御素的表达研究发现，sBD－2基因在十二指肠、肺、子宫中的表达均呈一致性增长趋势，提示防御素的表达调控可能受到环境因素的多因子的动态影响［9］。

本试验发现，怀孕3个月龄的小尾寒羊子宫内膜组织β－防御素mRNA的表达量明显高于未孕子宫，表明β－防御素mRNA的表达随机体的机能状态会发生变化，在生殖生理的机体免疫中有着重要的作用。为进一步研究β－防御素mRNA的表达与生殖生理的机体免疫机制奠定理论基础。

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