猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选

郜 原，薄联锋，武小椿，孙 柏，温俊歌，孙 岩，徐志坤，张德礼

（西北农林科技大学动物医学院 兽医微生物学与病毒学课程组病毒免疫与生物信息研究室，陕西 杨凌712100）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种严重危害着我国乃至全世界养猪业发展的猪免疫抑制性疾病，尤其是高致病性猪蓝耳病的暴发，对我国养猪业造成了极大损失。但受限于病毒主要结构蛋白GP5超变异性等原因，PRRSV 疫苗开发受到严重制约［1］，目前 microRNA（miRNA）的病毒调节作用引起人们广泛关注。miRNA是一类小分子非编码单链RNA，大小约18～25bp，成熟的miRNA在细胞内和靶基因的3′端非编码区（3′utr）互补，调节基因表达，抑制病毒复制。本试验旨在寻找猪体与PRRSV 3′utr发挥作用的miRNA，为PRRSV乃至高致病性猪蓝耳病的防治探索新方法。

1 材料与方法

1.1 细胞系、血清与细胞培养基 猪脐静脉血管内皮细胞系（SUVEC）为西北农林科技大学张彦明教授惠赠；胎牛血清购自HyClone；高糖DMEM购自Invitrogen公司。

1.2 主要酶、试剂与载体 内切酶PmeⅠ、XhoⅠ，购自纽英伦生物技术（北京）有限公司；LipofectamineTM2000，购自Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶；双荧光素酶载体psiCHECKTM－2、双荧光素酶检测试剂盒，购自Promega公司。

1.3 miRNA、PRRSV 3′utr和引物的合成 人工合成ssc－miR－323、ssc－miR－105－1及两者的抑制物inhibitor，由上海吉玛制药技术有限公司合成，同时合成阴性对照miRNA Control及相应抑制物inhibitor control。

根据GenBank中公布的PRRSV JXA1株基因序列（GenBank登录号：EF112445），获得病毒3′utr序列，将两端分别加上酶切位点PmeⅠ和XhoⅠ，送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用Primer软件 设 计 1 对 3′utr引 物 P1：5′－ACCTCGAGTGGGCTGGCATTCTTTGG－3′； P2：5′－TGGTCGACAATTACGGCCGCATGGTTC－3′，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其中斜体部分为PmeⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1.4 PRRSV 3′utr双荧光素酶重组载体的构建将公司合成并转入pUC－3′utr的载体菌接于普通LB培养基中，37℃过夜摇起，提取质粒，PmeⅠ／XhoⅠ37℃2h双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收157bp大小的目的片段，与经相同双酶切处理的psiCHECKTM－2载体用T4连接酶4℃连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄抗性筛选摇菌提取质粒，PmeⅠ／XhoⅠ双酶切鉴定及PCR鉴定，送往南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.5 生物信息学预测与PRRSV 3′utr作用的潜在miRNA 根据miRBase公布的猪76条miRNA，结合Mirnada，RNAhybrid和RNA22三个网络软件，预测PRRSV 3′utr有潜在靶标的猪miRNA，选出可能性最大的miRNAs进行试验。

1.6 重组质粒与miRNA转染猪血管内皮细胞（SUVEC） 大量摇菌，提取psiCHECK－utr和psi－CHECKTM－2质粒。将合成的miRNAs及其抑制物分别与psiCHECK－utr质粒共转染SUVEC，设立空载体对照，依照LipofectamineTM2000试剂说明转染96孔板，各自设置6个复孔，转染设置组如下：1：psiCHECKTM－2vector，2：psiCHECK－utr，3：miRNA control；psiCHECK－utr，4：inhibitor control；psiCHECK－utr，5：miR－323；psiCHECK－utr，6：miR－323inhibitor；psiCHECK－utr，7：miR－105－1；psiCHECK－utr，8：miR－105－1inhibitor；psiCHECK－utr，9：miR－323；miR－105－1；psiCHECK－utr，10：miR－323inhibitor；miR－105－1inhibitor；psiCHECK－utr。转染后分别于24、36、48h进行双荧光素酶活性检测。

1.7 转染组细胞的双荧光素酶活性检测 将转染完成后细胞培养板中的培养液弃去，按照双荧光素酶检测试剂盒说明，用微孔板发光分析仪检测萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）和海参荧光素酶（renilla luciferase）活性。

2 结果

2.1 psiCHECK－utr重组载体的鉴定 将构建好的psiCHECK－utr重组载体做PCR鉴定和PmeⅠ／XhoⅠ双酶切鉴定，均得到了大小157bp的目的条带（图1），测序结果与标准序列一致，psiCHECK－utr重组载体构建成功。

图1 psiCHECK－utr重组载体的双酶切和PCR鉴定

2.2 生物信息学预测与PRRSV相关的miRNAs

结合 Mirnada、RNAhybrid和RNA22三个靶标预测软件，筛选到3条潜在的猪miRNAs：ssc－miR－323、ssc－miR－105－1、ssc－miR－105－2，由 于 ssc－miR－105－1和ssc－miR－105－2同源，只有3′末端两个碱基互换，选取其中的ssc－miR－105－1进行本次试验。

2.3 双荧光素酶检测结果

2.3.1 psiCHECK－utr受SUVEC细胞作用影响

转染psiCHECK－utr和psiCHECKTM－2空载体对照的SUVEC细胞，双荧光素酶试剂检测发现，psi－CHECK－utr发光比率相比对照组在24、36、48h都略有上升，48h时最明显（图2），说明SUVEC细胞对PRRSV 3′utr表达没有抑制效果，进行t检验发现，3组产生的变化差异都不显著，可能说明细胞中相关miRNA对PRRSV 3′utr没有抑制作用，而且某些未知因素有利于PRRSV 3′utr的表达。

2.3.2 psiCHECK－utr与 ssc－miR－323、ssc－miR－105－1共转染细胞双荧光素酶检测 重组载体psi－CHECK－utr分别与ssc－miR－323、ssc－miR－105－1以及两者混合物共转染SUVEC，设置miRNA Control做对照，36h、48h后检测（图3），可以看到psi－CHECK－utr与ssc－miR－105－1共转染组以及与两个miRNAs的混合共转染组荧光比率在36h和48h较对照组都有所下降，48h时变化更明显，抑制率可以达到 30%，而 psiCHECK－utr与ssc－miR－323共转染组荧光比率较对照组没有下降，说明sscmiR－105－1可能对PRRSV 3′utr有一定抑制的作用，不过差异显著性检验并没有发现试验组与对照组之间有显著性差异。

图2 psiCHECK－utr转染SUVEC细胞后双荧光素酶相对活性比较

图3 psiCHECK－utr与ssc－miR－323、ssc－miR－105－1共转染细胞双荧光素酶相对活性比较

2.3.3 psiCHECK－utr与 ssc－miR－323、ssc－miR－105－1抑制物共转染细胞双荧光素酶检测 重组载体 psiCHECK－utr 分 别 与 ssc－miR－323、ssc－miR－105－1的抑制物以及两者的混合物共转染SUVEC细胞系，同时设置inhibitor control做对照，36h、48 h后，双荧光素酶试剂检测（图4），柱状图看到，加入miRNA抑制物的各试验组比对照组略有下降，但差异不明显。

2.3.4 ssc－miR－323、ssc－miR－105－1 对 PRRSV 3′utr表达的影响 分别分析ssc－miR－323和sscmiR－105－1对 PRRSV 3′utr抑 制 作 用，设 置 psi－CHECK－utr单独转染做对照（图5），发现ssc－miR－323转染后，双荧光素酶发光比率略有上升，与2.3.1中psiCHECK－utr转染SUVEC后荧光比率上升情况相同，说明ssc－miR－323对 PRRSV 3′utr表达没有抑制作用；而转染ssc－miR－105－1后，发光比率有所下降，36h和48h抑制率都在13%左右，而转染ssc－miR－105－1抑制物后，发光比率恢复，说明sscmiR－105－1对PRRSV 3′utr表达是有抑制作用的。

图4 psiCHECK－utr与ssc－miR－323、ssc－miR－105－1抑制物共转染细胞双荧光素酶相对活性比较

图5 ssc－miR－323和ssc－miR－105－1对PRRSV 3′utr抑制作用的双荧光素酶相对活性检测

3 讨论

已经有大量研究证明，细胞miRNA可以对病毒起到调节作用［2］，miRNA与PRRSV的研究有助于为PRRSV防控带来新的机遇，双荧光素酶报告基因是目前国际上通用的对miRNA及靶标进行验证的工具载体［3］。

本试验对计算机预测［4］到的3条猪miRNAs进行验证，发现了一些现象，首先psiCHECK－utr载体转染SUVEC细胞后，荧光比率没有下降，反而上升，说明PRRSV 3′utr表达没有被抑制，暗示细胞系自身的miRNAs对PRRSV 3′utr表达不具有抑制作 用。而在转染 ssc－miR－323 和 ssc－miR－105－1抑制物的试验组中，发现PRRSV 3′utr表达反而略受抑制，这或许说明细胞中能与PRRSV 3′utr作用的miRNAs被某些因素抑制了。在ssc－miR－323共转组中，发现PRRSV 3′utr表达不但没有抑制，相反略有上升，与psiCHECK－utr单独转染SUVEC结果相同，说明ssc－miR－323对 PRRSV 3′utr并没有抑制作用。而在ssc－miR－105－1的转染组中，发现PRRSV 3′utr有一定抑制，而且ssc－miR－323和sscmiR－105－1混合转染组结果也证实了这一点，但是抑制效果并不明显，抑制率只有13%～30%。同时，进行 PRRSV 3′utr BLAST 比对后，发现PRRSV 3′utr具有极高的保守性，已知的PRRSV所有毒株保守性都高达94%以上。推测可能也正是PRRSV针对宿主miRNA长期筛选进化的结果，使得病毒3′utr能够逃避宿主miRNA的抑制，得以在宿主细胞中持续感染和长期存活。

［1］Meng X J.Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus：implications for current vaccine efficacy and future vaccine development［J］.Vet Microbiol，2000，74（4）：309－329.

［2］Sung T L，Rice A P.MiR－198Inhibits HIV－1Gene Expression and Replication in Monocytes and Its Mechanism of Action Appears To Involve Repression of Cyclin T1［J］.PLoS Pathogens，2009，2（5）：1－13.

［3］侯勃，张彦明，朱晓娟，等.猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒相关microRNA的初步筛选［J］.畜牧兽医学报，2010，41（5）：576－580.

［4］Peng X X，Chan E Y，Li Y，etal.Virus－host interactions：from systems biology to translational research［J］.Current Opinion in Microbiology，2009，7（12）：432－438.