鹅新城疫病例诊断报告

蒋运博，谷松至，杜东菊，王 新，董 浩，胡桂学

（1.吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春130118；2.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春130118）

1 发病情况

吉林省梅河口市某鹅场共饲养6 800只鹅，其中包括6 000只榔头鹅的种鹅和800只吉林白鹅。本实验室从该场购买了20只吉林白鹅。购买前此批鹅无任何发病迹象，经近5h的汽车运输到达本校。自购买后次日开始，少数鹅出现食欲不振、精神委靡等症状，第5天后开始出现死亡。在购置这批鹅之前，该鹅场未曾有过关于疫情的报告，但在该鹅场周边，有散养的鸡和不明原因死去的雏鹅，死亡雏鹅未进行无害化处理和掩埋。该养殖场管理不够严格，人员可自由出入。经同期调查，鹅场同批饲养的榔头鹅与吉林白鹅也有少数发病。

2 临床症状与病理剖检

病鹅表现为逐渐消瘦，脚软无力，行走摇摆不稳；头缩颈软，采食减少或废绝；张口呼吸，甩头；排黄绿色稀便，产软壳蛋和畸形蛋。

随机剖检3只病死鹅发现，腺胃有明显的渗出性出血；肝脏、肾脏、脾脏有不同程度的肿大、充血；气管、肠道出血；胰脏肿大、质地硬而脆；卵黄流入腹腔、质地坚硬且形状不规则。

3 实验室诊断

3.1 细菌学检验 取鹅的肝脏和脾脏，涂片、染色、镜检，未见细菌。无菌操作取心血和肝脏，经普通营养琼脂培养基、血琼脂培养基和麦康凯培养基进行细菌的分离培养，结果均未分离到细菌。

3.2 病毒分离 取死亡鹅的肝脏和脾脏，用研钵研碎，以无菌PBS制成组织悬液，离心后取上清加入双抗过夜。次日接种15只9日龄鸡胚，24h内鸡胚死亡2只，认为是操作失误弃去；其余13只鸡胚分别在48～72h内死亡，提取并保存鸡胚尿囊液。观察死亡鸡胚，发现胚体全身充血，头部和肢端尤为明显，且有点状出血。

3.3 病毒的鉴定

3.3.1 血凝试验与血凝抑制试验 将鸡胚尿囊液倍比稀释，与1%鸡红细胞悬液做血凝试验，结果死亡鸡胚混合尿囊液能凝集鸡红细胞，血凝效价为1∶32。取4个血凝单位鸡胚尿囊液与鸡新城疫、禽流感H5和H9阳性血清进行血凝抑制试验，结果为新城疫病毒阳性血清血凝抑制试验呈阳性。

3.3.2 RT－PCR鉴定 取病毒尿囊液按常规方法提取RNA，反转录后进行PCR鉴定。根据文献［1］报道，合成新城疫强、弱毒鉴定引物。引物A＋B为针对NDV的通用引物，引物A＋C为针对NDV的强毒的引物，A＋D为针对NDV的弱毒的引物，引物序列及其位置如表1。

表1 引物的序列及其位置

PCR反应在25μL反应体系中进行：d NTP 2.0μL、ddH2O 17.2μL、模板cDNA 2.0μL、上下游引物各1.0μL、TaqDNA聚合酶0.3μL、10×PCR缓冲液2.5μL。反应条件为：95℃预处理4min，进行30个循环反应，每个循环反应包括：94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，循环完成后，72℃充分延伸10min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，在120V条件下电泳30min结果如图1。

由图1可见，3泳道出现目的条带证明该病毒为新城疫病毒，2泳道出现目的条带同时1泳道未见条带，证明该病毒为新城疫强病毒。

图1 PCR产物电泳图

4 讨论

通过对此批吉林白鹅的发病情况、临床症状、病理剖检的观察，结合实验室检验，确定造成此批白鹅死亡的病原为鹅新城疫病毒。

新城疫病毒基因组为单分子负链单股RNA，大小为15～16kb，包括六段基因，编码6个主要的蛋白质，其中F蛋白是最主要的糖蛋白之一［2］，具有良好的免疫原性，是病毒毒力的主要决定因素。由于NDV毒力强弱与F蛋白裂解位点区112～117位氨基酸序列的组成有关，弱毒株在该区的氨基酸序列为GR（K）QGRL，强毒株为 RRQK（R）RF［3］。本试验据此设计了 RT－PCR 引物［4－6］，此引物可以用于新城疫强、弱毒株的鉴定。根据RT－PCR结果推出，该场鹅携带的为新城疫强毒。通常认为鹅新城疫病毒不感染水禽，而水禽常作为其携带者，但不表现明显的临床症状。任涛等曾用新城疫病毒攻击28日龄的鹅，未引起接种鹅发病和死亡［7］。因此推测引起此批白鹅发病的原因有以下几点。首先，我国商品鸡群中普遍存在ND强病毒。NDV污染鸡场后，在病鸡体内大量复制、循环，使毒力增强，并长期维持下去，一旦遇到免疫水平低的鸡群或免疫力不足的鸡，极易发生非典型ND，本批外购鹅受长途运输、环境变化等各种应激因素影响导致鹅抵抗力下降，从而引发鹅体内新城疫病毒大量增殖；其次，虽然该鹅场内的成年鹅未见发病，但在鹅场周围有不明原因死亡而随便丢弃的未经无害化处理的雏鹅，同时周边有散养鸡的存在，因此此批鹅感染新城疫病毒可能与鸡鹅混养有关；再次，该养殖场饲养管理不善，卫生条件差，各种人员可以自由出入，没有完善的消毒措施，也可能是造成此批鹅感染新城疫病毒的原因。建议采取的防制措施为：加强运输过程中的饲养管理条件，减小应激反应造成的发病；加强养殖场内的卫生管理措施，不但进鹅前进行彻底消毒，而且进鹅后也要定期消毒，平时应禁止所有可能带毒的动物进入圈舍，并严格妥善处理病死畜禽；加强对人员的管理，出入时应进行严格消毒。

［1］Kant A，Koch G，van D J，etal.Differentiation of virulent and non－virulent strain of Newcastle disease viruswithin 24hours by polymerase chian reaction［J］.Avian Pathol，1997，26：837－849.

［2］刘成宏，金扩世，金宁一，等.新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联基因的构建及原核表达［J］.中国生物制品学杂志，2007，20（2）：73－76.

［3］Paterson R G，Shang hnessy M A，Lamb R A.Analysis of the relationship between cleavability of a paramyxovirus fusion protein and length of connecting peptide［J］.J Virol，1989，63：1293－1301.

［4］宋长绪，刘福安.新城疫病毒的分子生物学［J］.动物医学进展，1998，19（1）：9－12.

［5］金扩世，金宁一，王兴龙.新城疫病毒弱毒株分子生物学特性的研究［J］.中国预防兽医学报，2000，22（3）：193－195.

［6］张秀根，樊生超，缪德年.一株新城疫病毒新强毒株（NL）的分离鉴定及 F 基因序列测定［J］.病毒学报，2000，16（4）：352－356.

［7］吕晓娟，龚建森，刘学贤，等.鹅副黏病毒分离株的生物学特性鉴定［J］.安徽农业大学学报，2008，35（4）：530－534.