育肥牛肺炎性疾病的病原分离鉴定与防治措施

王 开，裴志花，臧亚茹

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春130118；2.吉林农业大学发展学院，吉林 长春130118）

自2008年以来，本省部分地区育肥牛出现了一种以咳嗽、喘为主的疾病，剖检死亡牛后发现，肺脏全部或部分糜烂，与肋骨粘连，给养牛户造成极大的经济损失，严重影响到了人们的养牛积极性。为了确定其病原，本文重点从巴氏杆菌、支原体等两个方面，对来自不同地区的病牛进行病原的分离和鉴定，研究其防控措施。

1 材料

1.1 病原材料 某肉牛场即将死亡的病牛1头，某屠宰场带有咳嗽症状的病牛3头，某养殖户病死牛1头，以上病料均来自不同地区，无菌采集病牛的心脏、肺脏和肝脏。

1.2 培养基与生化试剂 鲜血琼脂培养基、麦康凯培养基、MH培养基、爱德华氏培养基，由临床实验室参照参考文献［6］配制。

1.3 实验动物 健康小鼠，体重20～25g，健康家兔，体重1 500～2 000g，均购自吉林大学实验动物中心。

1.4 药敏试验 抗生素包括阿奇霉素（AZM）、头孢噻肟钠（CTX）、替米考星（TMS）、头孢曲松钠（CRO）、硫酸新霉素（NEO）、环丙沙星（CIP）、酒石酸泰乐菌素（TEL）、氟苯尼考（FBK）、卡那霉素（KAN），药敏纸片的制备均按照NCCLS（美国临床实验室标准化委员会）的标准由临床实验室自制。

2 方法

2.1 临床症状检查 对出现咳嗽、喘的病牛进行临床症状检查。

2.2 病理剖检 对以咳嗽、喘为主要症状死亡的病牛进行剖检，观察其主要病理变化。

2.3 细菌学检验

2.3.1 涂片染色镜检 将病料组织触片进行瑞氏染色和革兰染色，镜检观察染色特性及形态特征。

2.3.2 分离培养 无菌采集濒死期病牛的心血、肺脏、肝脏，分别接种于脑心浸液肉汤，置恒温箱37℃增菌培养24h后，首先是接种于鲜血琼脂平板和麦康凯平板，37℃培养24h，观察细菌生长情况、菌落形态以及是否溶血。挑选典型的单个菌落转接于血琼脂平板培养基上进行分离纯化。其次是接种于爱德华氏培养基，培养时间在48h以上，观察是否有支原体的生长。

2.3.3 生化鉴定 分离菌的生化鉴定按常规方法进行，参照参考文献［6］。

2.3.4 动物试验 取健康小鼠15只，随机分为2组，第1组12只分别腹腔注射菌量为103、105、107、109，每个菌量注射3只小鼠；第2组3只腹腔注射无菌生理盐水作对照组，逐日观察发病死亡情况。给2只兔进行腹腔注射，观察病变情况。

2.3.5 药敏试验 用K－B纸片扩散法进行药敏试验，判定依照NCCLS（美国临床实验室标准化委员会）标准。

2.3.6 治疗性试验 利用筛选到的敏感性药物，对临床病例进行治疗，观察治疗效果。

3 结果

3.1 临床症状观察 病牛发热，体温升高达40℃～42℃，食欲减退，反刍迟缓，腹式呼吸，呼吸频率为60～90次／min。多数牛干咳，每次连续1～2声，发出“吭吭”的声音。病牛呼吸急促，少量流涎，舌面有溃疡，结膜潮红，并排出浆液性白泡样鼻汁。随着病情发展，部分病牛出现拉稀，甚至血便。个别病牛出现跛行、关节脓肿等，最终逐渐消瘦，甚至衰竭死亡。

3.2 病理剖检观察 眼观病理变化以肺脏变化最明显，4／5的肺脏发生肉变，质地较硬，小叶间结缔组织浆液性水肿而增宽，切面呈大理石样花纹；有的病牛肺脏大部分和纵膈、胸腔粘连，胸腔内有大量脓液，甚至一侧肺叶成为一大脓肿肺。真胃溃疡，其他未见异常。

3.3 细菌学诊断

3.3.1 细菌形态观察 病死牛的肺脏、肝脏、心血触片瑞氏染色镜检，可见大量两极浓染的短杆菌，革兰染色可见革兰阴性的小杆菌。

3.3.2 病原菌分离培养及培养特性 分离菌在普通琼脂上生长贫瘠，在麦康凯琼脂上不生长。在鲜血琼脂平板上培养24h后，出现灰白色、光滑湿润、边缘整齐的水滴样小菌落，无溶血现象，革兰染色为阴性杆菌。爱德华氏培养基上未见菌落生长。

3.3.3 生化鉴定结果 见表1。

表1 生化鉴定结果

3.3.4 动物试验结果 不同浓度菌悬液腹腔注射小鼠后10只小鼠在36h内全部死亡，其中注射菌量为105、107、109的小鼠在12h内死亡，对照组小鼠正常，剖检死亡小鼠，瑞氏染色镜检可见两极浓染的巴氏杆菌。腹腔注射菌悬液的3只家兔在注射后3d死亡，对照组家兔正常。剖检可见死亡家兔肺组织纤维素性渗出，心包膜与胸膜粘连，取心血、肝、肺涂片，瑞氏染色镜检可见两极浓染的巴氏杆菌。

3.3.5 药敏试验结果 依照NCCLS（美国临床实验室标准化委员会）标准，最敏感的药物为硫酸新霉素（NEO），其次依次为阿奇霉素（AZM）、头孢曲松钠（CRO）、头孢噻肟钠（CTX），而替米考星（TMS）、环丙沙星（CIP）、酒石酸泰乐菌素（TEL）、氟苯尼考（FBK）、卡那霉素（KAN）均不敏感。

3.3.6 治疗结果 使用硫酸新霉素和头孢曲松钠进行早期的治疗，效果显著，但对于晚期病例，效果不理想。

4 分析讨论

我国2008年首次报道从犊牛肺脏中分离到牛支原体［5］，由于目前我国对 M.bovis监视的低估，导致牛支原体引起的疾病在我国已经普遍发生。根据我国部分文献显示，自2008年以来，我国部分地区从外地新引进的肉牛都暴发了牛支原体肺炎，其发病率为50%，病死率高达10%～50% ，给我国养牛业造成了巨大的经济损失，引起了国家有关部门的高度重视［7－8］。因此，本试验也进行了支原体的分离培养，但未分离到该病原。由于支原体非常难培养，本次试验是否存在假阴性，在将来的试验中还要进一步研究。

从主要临床症状和剖检变化上看，类似于多杀性巴氏杆菌（Pm），但与以往不同的是此次发病死亡的育肥牛在剖检过程中并未发现有明显的内脏器官的出血性炎症及各浆膜黏膜出血，而是以肺部化脓感染或肉变为主要特征，且发病率和死亡率都高于以往。本试验从不同地区采集的病料进行细菌分离培养共获得5株分离菌，分离株在血琼脂培养基上形成灰白色、边缘整齐的露珠样菌落，形态特征及培养特性与以往引起成年牛败血病症状的巴氏杆菌相符；分离菌株生化鉴定结果与多杀性巴氏杆菌的生化特性一致。将分离的纯培养物注射小鼠表现出高度致病性，在注射分离株纯培养物的家兔体内分离到相同的细菌，故鉴定为多杀性巴氏杆菌感染。

受牛的经济价值和其他因素的影响，采集病死牛的病料变得十分困难，因此本试验尝试了采集病牛的鼻液，但分离到的都是一些杂菌，未培养到Pm和支原体，说明本病的细菌分离培养还是以濒死病牛的心血、肝血为主，尤其是化脓的肺脏最好。在国内近年来有过关于牛巴氏杆菌病的报道，如李平安等报道了巴氏杆菌引起犊牛死亡的病例［9］，马文戈等［10］首次报道在2008年东北地区部分牛场出现由荚膜A型Pm引起犊牛死亡，显示我国新出现了牛源荚膜血清A型Pm。马晓菁等在新疆地区发现了由荚膜A型血清型引起的犊牛死亡且表现症状与以往的败血性不同，主要表现为肺部感染、腹泻，造成犊牛急性死亡［11］。

从发病原因来看，主要是从外地购牛、运输应激及天气突变，导致个别牛出现咳嗽、喘等临床症状；东北地区冬季寒冷、牛舍氨气等有害气体严重超标、通风不良、湿度大等加剧了病情；“自繁自养”、病牛隔离饲养、圈舍消毒等简直是空谈，私宰滥宰等不正之风导致本病迅速传播。针对以上问题，我们应采取正确的防控措施。首先，新引进的牛一定要隔离饲养，发病牛及时隔离或淘汰，以防病原感染健康牛或继发感染；加强防疫意识，严把注射器消毒和牛舍消毒等环节，以减少疾病的传播；加强圈舍的保温、通风设计，营造一个良好的饲养环境。其次，摸索一个适合本地区、本养殖场的饲养模式。目前我们还很难摆脱人畜混居的局面，或者说我们养殖的大环境并不理想，导致一些疾病时有发生，因此建议饲养规模不宜太大。最后，从试验结果来看，使用硫酸新霉素和头孢曲松钠等药物比较敏感。发病牛要早期治疗，对于发烧40℃以上的病牛，最好静脉注射，但输液的速度一定要慢，否则容易引起肺水肿及心脏负担过大而出现心律失常。

［1］陆承平.兽医微生物学［M］.北京：中国农业出版社，2001：195－196.

［2］吴移谋，叶元康.支原体学［M］.北京：人民卫生出版社，2008：9－10，16－25.

［3］Maunsell P F，Arthur G D.Mycoplasma bovis infections in young calves［J］.Vet Clin Food Animal，2009，25：139－177.

［4］Caswell J L，Archambault M.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle［J］.Animal Health Res Rev，2008，8（2）：161－186.

［5］辛九庆，李媛，郭丹，等.国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体［J］.中国预防兽医学报，2008，30（9）：661－664.

［6］姚火春.兽医微生物学实验指导［M］.2版.北京：中国农业出版社，2002：19－21.

［7］董慧，辛九庆，李媛，等.8株牛支原体分离株P81表面膜蛋白基因的克隆与序列分析［J］.中国预防兽医学报，2010，32（3）：233－234.

［8］石磊，龚瑞，尹争艳，等.肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断［J］.华中农业大学学报，2008，27（5）：629－633.

［9］李平安，杨莲茹，商晓桂，等.牛溶血性巴氏杆菌的分离鉴定［J］.内蒙古农业大学学报，2008，29（1）：1－3.

［10］马文戈，于力.牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定［J］.中国预防兽医学报，2008，30（10）：747－750.

［11］马晓菁，王静梅，剡根强.犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定［J］.中国兽医学报，2010，30（9）：1193－1196.