T24膀胱癌细胞ARID1A基因的表达与细胞增殖活力相关性研究

吴金斌，漆正宇，晏耀明，翟庆娜，余振东

（1.北京大学深圳医院 检验科，2.北京大学深圳医院 男性生殖与遗传重点实验室，广东 深圳518036）

膀胱癌是一类常见的泌尿系统恶性肿瘤，其中移行细胞癌占膀胱癌发病率的90%以上［1］。染色质重建复合物SWI／SNF亚基AT丰富结合域1A基因（AT rich interactive domain 1A，ARID1A）是近两年来肿瘤研究关注的一个重要基因，膀胱移行细胞癌中ARID1A高比率突变［2］，但我们前期测序发现在膀胱癌细胞系T24中ARID1A可以正常表达。ARID1A作为一个染色质重建复合物亚基基因，跟细胞增殖密切相关［3］。本研究通过有限稀释方法分离出膀胱移行细胞癌细胞系T24的高增殖活力亚克隆细胞株，体外评价ARID1A表达与细胞增殖转移潜能关系，并为进一步研究ARID1A基因功能提供目的细胞。

1 材料和方法

1.1 材料

基础培养基 H－DMEM（Gibco USA），10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gibco USA），左旋谷氨酰胺（Gibco USA），青霉素和链霉素合剂（Invitrogen USA），胰 酶 （Gibco，USA），Trizol（Invitrogen，USA），CellTiter 96○RAQueous One Solution Cell Proliferation Assay（a）（Promega，USA），Platinum○RSYBR○RGreen qPCR SuperMix UDG kit（Invitrogen，USA）。

1.2 方法

1.2.1 T24细胞培养 T24细胞系为本实验室保存，传代培养。培养基包括90% 基础培养基HDMEM，和10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），同时添加1mmol／L左旋谷氨酰胺、100U／ml青霉素和100μg／ml链霉素合剂。细胞消化采用0.25%胰酶。在培养基中添加10%体积FBS和8%DMSO配成冻存液，按常规流程液氮冻存细胞。

1.2.2 高增殖亚克隆细胞株形成 将生长旺盛的T24细胞从培养皿消化后，稀释到1×102个／ml，以1／2浓度梯度稀释接种到96孔板中，5h内在倒置显微镜下观察，标记单细胞孔，第10天将从单细胞扩增形成的细胞亚克隆传至24孔板，得到亚克隆细胞株。亚克隆细胞株传代培养至第3代，均一化接种培养并每天计数显微镜视野细胞数，估测筛选高增殖细胞株。

1.2.3 细胞增殖活力比较 采用CellTiter 96○RAQueous One Solution Cell Proliferation Assay（a）试剂，MTS法检测亚克隆细胞与T24亲代细胞增殖活力，分别在1、3、5和7天选择时间点检测。

1.2.4 RT－qPCR 检测 采用常规 Trizol试剂提取细胞RNA。逆转录反应采用Fementas ReverseAid First Strand cDNA Synthesis Kit，反应体系为20μl。采用 Platinum○RSYBR○RGreen qPCR SuperMix UDG kit对目的基因进行qPCR相对定量，比较细胞增殖相关基因CCND1（cyclin D1）表达，并通过定量膀胱癌肿瘤干细胞标志基因CD44来进一步验证细胞增殖特性。定量ARID1A在不同增殖活力细胞中的表达。目的基因及内参GAPDH 跨外显 子正反 向引物序列 （5′－3′）为：CCND1（sense：FGCATCTACACCGACAACTCCA ，antisense：GCACAGAGGGCAACG AAG）；CD44（sense：GTTCCTGGACTGAT，antisense：AATTACTCTGCTGCG TTG）；ARID1A（sense：AGGACGGAGCCTGGAATA，antisense：CCTTGGGTG GAGAACTG A）；GAPDH（sense：ATCATCAGCAATGCCTCC，antisense：CAT CACGCCACAGTTTCC）。PCR反应条件为94℃20sec，55℃20sec，72℃20sec，共35个循环。

2 结果

2.1 获得高增殖亚克隆细胞株T24－9

T24分离得到65株亚克隆细胞，其中T24－9细胞株培养计数表现出较强的增殖活力。

2.2 T24－9细胞形态学特征

T24－9体积较亲代T24明显偏小，与T24的纺锤形外形不同，T24－9呈干细胞样的细小圆球形（图1）。

图1 T24－9与T24细胞形态学差异（bar＝100μm）

2.3 细胞增殖活力定量比较

生长曲线显示，除传代第1天外，T24－9在第3、5和7天较T24具有更强的增殖活力（图2）。

图2 T24－9和T24生长曲线（n＝4）

2.4 基因转录水平比较

基因转录水平相对定量分析显示，增殖相关基因CCND1在T24－9中较T24中显著高表达。肿瘤干细胞标志物表达T24－9高于亲代T24，但差异并不显著。ARID1A的表达情况与CCND1类似，T24－9表达水平高于T24。

3 讨论

ARID1A是染色质重建复合物SWI／SNF的一个亚基，能促进细胞的增殖，其缺失将严重干扰胚胎干细胞的正常发育［4］。从2010年发现ARID1A在子宫内膜异位相关卵巢癌中高达50%以上的突变以来［5，6］，ARID1A在肿瘤研究中受到极大关注。2011年发现膀胱移行细胞癌中ARID1A也有高达13%的突变［2］。虽然与细胞增殖有密切关联，ARID1A在肿瘤发生和发展中的作用机制仍然未知。

图3 T24－9和T24中CCND1、ARID1A和CD44转录水平比较（n＝3，P＜0.05）

本研究通过分离得到膀胱癌细胞系亚克隆T24－9，生长曲线显示较亲代T34细胞具有更强的增殖活力。CCND1表达的Cyclin D1蛋白是细胞G1／S期过渡的重要调控因子，促进细胞周期进行，其表达上调可以使细胞生长失控［7］。相对定量分析显示，亚克隆T24－9比亲代T24具有更高的CCND1表达量，进一步证实了T24中存在基因表达特点有差异的高增殖活力细胞亚群。

肿瘤干细胞理论认为，肿瘤细胞在成瘤能力上具有不均一性，只有少数高转移潜能的肿瘤干细胞细胞亚群才有能力诱发并维持肿瘤恶性，只有征对肿瘤干细胞进行治疗才有可能完全抑制肿瘤［8］。形态学显示T24－9呈细小的圆球形快速生长。通过检测膀胱癌肿瘤干细胞标志物CD44［9］，发现T24－9较T24的表达水平高，但差异不具有显著性意义，可能是亲代细胞系本身即具备了某种永生化特点，某些肿瘤干细胞标志物表达呈现阳性。结果表明，T24－9是一个具有肿瘤干细胞样特点的细胞亚群。

ARID1A基因长达86kb，包含32个外显子，cDNA长8kb，而且，ARID1A的在酵母中的正常转录量只有大约100个拷贝［3］，其功能研究受到其长度和表达量的双重制约。我们测序发现T24膀胱癌细胞ARID1A正常表达，可以作为ARID1A功能研究一个目的细胞。分离高增殖活力的T24－9亚克隆，定量结果显示T24－9中ARID1A表达量较亲代细胞系有10倍以上的增加。作为一个促进细胞增殖的基因，ARID1A表达增加或许为细胞增殖所需要，而过度表达或许也是造成ARID1A突变的原因之一。高增殖活力的T24－9亚克隆细胞株的分离，为进一步研究ARID1A在膀胱癌发生和发展的相关作用提供了基础。

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