皂角刺总黄酮对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和侵袭能力影响的实验研究

何光志

(1.贵阳中医学院，中国 贵阳 550002；2.大岭山畜牧兽医站，中国 东莞 523820；3.贵州省疾病预防控制中心，中国 贵阳 550003;4.贵阳学院， 中国 贵阳 550005)

皂角刺, 又称天丁、皂针等，为豆科植物皂荚(GleditsiasinensisLain.)的干燥棘刺，主要产于江苏、湖北，以及四川和贵州等地．皂角刺在中医临床中应用历史悠久，据《本草纲目》记载：“消肿脱毒，妒乳，风疠恶疮，排脓，杀虫”[1]．现代医学证实，皂角刺具有抗菌、抗病毒和抗癌等作用．皂角刺总黄酮是皂角刺的提取物．本研究通过提取皂角刺总黄酮，体外细胞培养肝癌HepG2细胞, 探讨皂角刺总黄酮对HepG2细胞细胞株的增殖和凋亡的影响, 从不同角度研究其抗肿瘤作用机制，旨在为深入开发利用皂角刺这一中药材提供依据．

1 主要试剂与仪器

人肝癌细胞株HepG2，购自中科院生物化学与细胞生物学研究所；MEM、DMEM、青霉素和链霉素，购自Gibco公司；96、6孔细胞培养板，购自Costar公司；胎牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Quick Apoptotic DNA ladder Detection kit，购自Biovision公司；流式细胞仪，购自美国Becton Dickson公司；琼脂糖，购自上海生工生物工程有限公司; DMSO，购自北京亚太精细化工公司产品；WST-1，Quick Apoptotic DNA ladder Detection Kit试剂盒，大连宝生物；Transwell小室，购自美国Corning公司；纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)和基底膜基质凝胶(Matrigel)，购自BD公司；倒置荧光显微镜，上海光学仪器厂；Model550型酶标仪，Bio-Rad公司产品；Transwell小室，美国Corning公司；流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC 试剂盒，购自美国BACKMAN COULTER 公司；WST-1，Amresco 科技公司产品．

2 方法

2.1 皂角刺总黄酮的提取

参照曹学锋等[2]方法进行提取．

2.2 细胞培养

采用MEM培养基(含10%灭活的胎牛血清、1.667 mkat/L青霉素和100 mg/L链霉素)培养人肝癌HepG2细胞培养；2种细胞株均置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养．

2.3 皂角刺总黄酮对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用

2.3.1 实验分组 对照组：每孔100 μL细胞悬液和10 μL DMSO稀释液；实验组：每孔100 μL细胞悬液和10 μL用DMSO稀释的皂角刺总黄酮，浓度分别为20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L共5组，每组设重复3次；空白组：每孔100 μL培养液及10 μL皂角刺总黄酮．

2.3.2 WST-1比色法测定皂角刺总黄酮对HepG2增殖的抑制作用 选取对数期的细胞消化后制成细胞悬液，用含体积比为10%的小牛血清的培养液调整细胞密度为2.5×106个/mL，置于96孔培养板进行培养，100 μL/孔．待细胞贴壁后，按实验设计给实验组加相应浓度皂角刺总黄酮各10 μL，对照组、空白组各加DMSO稀释液及皂角刺总黄酮10 μL；置于恒温培养箱中作用12、24和48 h后，每孔加入现配好的四氮唑-1(Water Soluble Tetrazolium-1，WST-1)溶液10 μL，继续培养2 h；酶标仪测定各孔光密度OD450值，记录结果，计算均值；细胞增殖抑制率=[1-(A给药组-A空白孔) /(A阴性对照组-A空白孔)]×100%，LOGIT 法计算半数抑制浓度(IC50)．实验重复3次．

2.4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化

取1 000 μL的HepG2细胞浓度1×106个/mL的细胞悬液加入6孔培养板中，然后加入500 μL不同浓度(20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L)的皂角刺总黄酮作用48 h后，1 000 g离心5 min，加40 μL TE细胞裂解液重悬细胞，采用Quick Apoptotic DNA ladder Detection Kit试剂盒抽提DNA，采用18 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，采用凝胶成像系统拍照分析．

2.5 流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测细胞凋亡

取对数生长期密度为1×106的HepG2细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞贴壁后弃上清，各组加入终浓度为20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L的皂角刺总黄酮作用48 h，采用胰酶消化、收集细胞，每样本细胞数均大于1×106个，用4 ℃的PBS洗涤后，加250 μL结合缓冲液混匀细胞，再加2.5 μL AnnexinⅤ-FITC和2.5 μL PI (终浓度均为1 mg/L)，避光作用20 min后立即采用流式细胞仪检测，计算细胞早晚期凋亡率．

2.6 细胞运动实验

采用Kantor等所用方法，在Transwell小室滤膜的下室面铺上10 μL FN(0.2 g/L)，自然晾干备用．含质量分数为0.1%的BSA(下同)的MEM培养基将处于对数生长期的HepG2细胞制成1×106个/mL的细胞悬液．实验分为皂角刺总黄酮组和对照组，皂角刺总黄酮组小室的上室中分别加入100 μL皂角刺总黄酮终浓度分别为20.0 mg/L(A组)、40.0 mg/L(B组)、80.0 mg/L(C组)的细胞悬液，下室分别加入600 μL皂角刺总黄酮浓度分别为20.0、40.0、80.0 mg/L的0.1%BSA的MEM．对照组上室加入不含皂角刺总黄酮的细胞悬液，下室加入0.1%BSA的DMEM 600 μL，各组均重复3孔．皂角刺总黄酮组和对照组均放入37 ℃ 5%CO2中培养48 h后取出滤膜，甲醇固定，去掉上室面的肿瘤细胞，采用苏木素-伊红(HE)染色．随机于显微镜下取上、下、左、右、中心5个视野，计数穿膜细胞数．以此细胞数目来表示肿瘤细胞的运动能力．

2.7 体外侵袭实验(穿膜实验)

采用Albini等所用方法，在Transwell小室的滤膜的下室面铺上FN并风干后，在小室上室面均匀铺上MEM稀释的Matrigel，置37 ℃培养箱30 min使之凝固，其余步骤与2.6相同．

2.8 统计学分析

所有实验数据采用SPSS10.0统计软件包进行分析．

3 结果

3.1 皂角刺总黄酮对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用

运用WST-1比色法，观察皂角刺总黄酮作用于HepG2细胞12、48、72 h后对细胞增殖的影响．与对照组比较，皂角刺总黄酮在12、48、72 h及各浓度(20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L)均对HepG2细胞有抑制作用(P<0.05)；同一时相不同药物浓度，同一药物浓度不同时相各组间两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)．随着药物浓度的提高和培养时间的延长，皂角刺总黄酮对HepG2细胞的抑制作用也逐渐增强，即具有剂量和时间依赖性．不同浓度的皂角刺总黄酮溶液作用于HepG2细胞48 h后的抑制作用最强，随着药物浓度的增高，对HepG2 细胞的抑制率也逐渐升高，与对照组比较有显著性差异，皂角刺总黄酮的IC50为(190.62±0.89) mg /L，见表1．

表1 皂角刺总黄酮对HepG2增殖的影响(OD值，±s，n=9)

注：**表示P<0.01．

3.2 凋亡细胞的DNA断裂

加入20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L的皂角刺总黄酮作用48 h后，细胞DNA均出现典型的DNA梯状条带(图1)，说明皂角刺总黄酮能诱导HepG2细胞的凋亡．

3.3 PI单标检测细胞凋亡率

在细胞周期G0/G1期前可检测到sub-G1峰(sub-G1期细胞占检测细胞的百分比即为凋亡率)．随着皂角刺总黄酮作用时间的延长，凋亡率逐渐升高，与对照组凋亡率0.23%±0.04%相比, 20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L的皂角刺总黄酮作用HepG2细胞48 h后的凋亡率分别为9.27%±0.11%、15.23%±0.36%、25.72%±0.80%、32.08%±0.51%(P<0.01)和43.97%±1.47%(P<0.01)．

3.4 迁移试验

划痕后肝癌细胞继续培养，48 h后观察20.0 mg/L(A组)、40.0 mg/L(B组)、80.0 mg/L(C组)3组细胞的平均迁移速率分别为(36.53±0.83)μm/h、(32.70±2.10)μm/h、(78.37±2.15)μm/h．A组和B组比较细胞迁移速率差异无统计学意义(P>0.05)，但A、B组细胞划痕后平均迁移速率显著低于C组，A、B组分别与C组比较，均存在差异，有统计学意义(P<0.01)．

3.5 穿膜实验

穿膜实验结果，皂角刺总黄酮浓度分别为20.0 mg/L(A组)、40.0 mg/L(B组)、80.0 mg/L(C组)3组浸过滤膜的细胞数目分别为(21.77±0.91)、(20.60±0.85)和(55.80±2.75)个．A组和B组比较穿膜细胞数无统计学意义(P>0.05)，但A、B组穿膜细胞数均明显比C组少，A组、B组分别与C组作比较，均存在极显著差异(P<0.01)．

4 讨论

(1)原发性肝癌占我国恶性肿瘤死亡率的第二位[3-6]，是我国最常见的恶性肿瘤之一．肝癌在临床诊断时多为中晚期，手术机会就会被延误．近年来，国内外治疗肝癌的其他新技术和新方法疗效依然不理想，中医药作为肝癌综合治疗的重要方法日益受到重视和肯定．

(2)中医药在预防肝癌发生、抑制瘤灶形成、防止复发转移等方面有着独特的优势[7-8]．广大学者借助现代医学手段，对中医药在癌前预防、癌中根治、防止复发与转移等的作用机理进行了一系列的实验研究，提供了客观的实验理论依据．据统计我国80%的原发性肝癌患者不同程度地接受过中医药治疗，中医药在控制患者病情发展、减少复发、改善症状体征、提高生存质量和延长生存等方面有着自己独特的优势．因此，深入研究有效的抗癌中药对肝癌细胞的凋亡和侵袭能力及其作用机制，对指导临床用药和研发中药抗癌新药具有重要的意义．

(3)抗癌中药的化学成分含黄酮、皂苷、三萜、氨基酸、酚类等，其中主要是黄酮类化合物．传统药物皂角刺来源广泛、作用多样、不良反应小，无论作为单味药还是复方组成，在临床应用上都是一味十分有效的中药材．徐哲等从皂角刺中分离得到黄酮中的化合物3β-acetoxyolean-12-en-28-oic acid 对人肝癌细胞株等7 种肿瘤细胞的生长均有较强的抑制作用[9]．

(4)皂角刺总黄酮是皂角刺的提取物．黄酮类化合物是一类天然有机化合物, 广泛存在于自然界中许多药用植物的根、叶、皮、果实以及水果和蔬菜中, 多以苷类形式存在, 一部分以游离形式存在, 具有多种潜在的药用价值. 其抗肿瘤作用的研究由来已久, 大约从20 世纪70年代起就有人发现黄酮类化合物具有较好的抗肿瘤作用[10]，其作用机制主要包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞的侵袭能力[11]．

(5)本研究通过四氮唑-1(Water Soluble Tetrazolium-1，WST-1)比色法检测皂角刺总黄酮对HepG2细胞体外增殖活性的影响，琼脂糖凝胶电泳的结果显示不同浓度的皂角刺总黄酮处理组出现了凋亡细胞所特有的DNA ladder条带，PI单染检测sub-G1峰结果表明皂角刺总黄酮都能诱导HepG2细胞凋亡并具有时间依赖性．

(6)肝癌的复发转移是肝癌死亡率居高不下的主要原因.肿瘤细胞能侵犯、破坏周围组织细胞，发生侵袭转移，是肿瘤复发的重要因素．肝癌细胞的侵袭转移是多步骤、多因素参与的复杂过程[12-13]．目前研究认为，肿瘤的侵袭和转移都需要借助于蛋白酶的表达与激活．基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是锌离子依赖的内分泌蛋白水解酶，它是人体内降解细胞外基质(extracellar matrix，ECM)的主要酶类，与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关[14-15]．本研究使用细胞迁移实验评价皂角刺总黄酮对肝癌细胞迁移运动能力的影响．结果提示皂角刺总黄酮对肝癌细胞的迁移运动能力具有明显的抑制作用，由此作者认为皂角刺总黄酮可抑制肝癌细胞向其他器官或组织转移．

总之，本研究结果表明，皂角刺总黄酮可以抑制肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和侵袭能力，为皂角刺总黄酮在临床上用于肝癌的治疗提供了一定的实验依据．

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