广西壳菜果遗传多样性的ISSR研究

彭继庆，曹福祥 许若娴

(中南林业科技大学生命科学与技术学院，中国 长沙 410004)

壳菜果(MytilarialaosensisLecomte)，别名米老排、三角枫、山桐油、米显灵、马蹄荷、朔潘[1]，属金缕梅科(Hamamelidaceae)壳菜果属(Mytilaria)常绿阔叶树种．天然林分布于广东的封开、信阳、阳春，广西西南部的十万大山、龙川、那坡、德保、靖西和云南南部，老挝和越南也有分布，垂直分布在广东海拔250～1 000 m，广西和云南在海拔1 100～1 800 m之间的山谷、丘陵的中下部和沟谷两旁[2]，是优良速生用材树种．其树干通直，枝条较细，材质较好，色泽美观，经久耐用，适于制作家具、胶合板等，在水土保持、土壤改良、混交造林、生物防火等方面作用明显[3-4]．壳菜果叶子肥大嫩绿，营养成分含量较高，是一种很好的饲料资源[5]；所分泌的树脂的化学成分主要是脂类物质[6]，其种仁含油质量分数高达36.8%，是重要的油脂资源[7]．目前对壳菜果的研究多集中在引种[8]、育苗造林[9]和材质利用等方面[2-3]，而壳菜果种群遗传多样性方面的文章迄今未见报道．

ISSR(inter simple sequence repeat)即简单重复序列区间扩增多态性，由Zietkiewiez等[10]在 PCR反应基础上发展起来的一种新的分子生物学技术，ISSR标记技术与RAPD相比具有检测位点多、稳定可靠、重复性更好等优点[11]；与AFLP相比具有操作简单、技术性低、花费低等优点，适合一般的实验室使用．因此ISSR分子标记技术已在生物种质鉴定、遗传多样性检测、基因定位及遗传图谱等方面得到广泛应用[12]．利用ISSR分子标记技术对壳菜果种群多样性进行研究有助于从DNA分子水平上揭示壳菜果种群的遗传结构和遗传多样性水平，了解壳菜果的生存状况和对环境的适应能力，了解壳菜果种群间的亲缘关系，为壳菜果的合理开发和利用提供参考依据．

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

壳菜果样品分别采自广西凭祥、广西德保、广西靖西、广西那坡4个壳菜果天然分布区，采样过程中要防止采到同一棵树的后代；每一样品为同一株的新鲜叶片，选取没有病虫害的比较干净的叶片，用纱布擦洗干净后放入自封袋中，加入一定量的硅胶，摇动袋子使硅胶与叶子充分接触．将样品放入保温箱中，加入冰袋带回实验室，置于-70℃超低温冰箱中保存备用．样品采集情况见表1.

表1 壳菜果种群分布地的基本情况

1.2 壳菜果基因组DNA提取及检测

壳菜果基因组DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组提取试剂盒进行提取，具体操作按照植物基因组提取试剂盒说明书进行，仅对离心时间和裂解时间稍作修改．

所提取的基因组 DNA 用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，倒胶前加入EB，终浓度为0.5 mg/L；用核酸蛋白测定分析仪检测DNA样品纯度和浓度，将所有样品DNA浓度稀释为 40 mg/L，置于-20 ℃冰箱中保存备用．

1.3 引物的合成与筛选

ISSR引物是根据加拿大哥伦比亚大学公布的第九套ISSR引物序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成．从中筛选出9条扩增条带较多、条带清晰、重复性好的引物用于ISSR-PCR扩增．

1.4 ISSR-PCR扩增与电泳检测

利用筛选出的9条引物对43个样品进行PCR扩增，ISSR-PCR扩增体系为：在20 μL的反应体系中，模板DNA为30 ng，Mg2+浓度为2.75 mmol/L，TaqDNA聚合酶为36.67 nkat，dNTPs浓度为0.20 mmol/L，引物浓度为0.6 μmol/L，10×PCR Buffer 2.0 μL，最后用灭菌好的ddH2O将体系补足．扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50～54 ℃(依据引物而定)退火45 s，72 ℃延伸90 s，36个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存．扩增产物用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，用200 bp DNA Ladder Marker(200～3 000 bp)作标记，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上成像，拍照．

1.5 数据处理与分析

M:200 bp DNA Ladder图1 引物UBC835对壳菜果的多态性扩增

电泳图谱中扩增出的每一条带代表引物的一个结合位点，视为有效的分子标记，同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性．根据电泳图谱中扩增条带的有无及扩增片段的大小，有条带的记作“1”，否则记作“0”，建立0/1数据矩阵，通过Popgene32软件计算壳菜果群落的多态性位点百分比(PPB)、观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shanon多样性指数(I)、种群总基因多样性(Ht)、种群内基因多样性(Hs)、种群间遗传分化指数(Gst)及Nei’s遗传距离(D)．

2 结果与讨论

2.1 广西壳菜果种群的扩增产物多态性

9条引物对4个种群的43份广西壳菜果样品进行扩增，结果显示，9条引物均能扩增出很好的图谱，(图1为引物UBC836对43份广西壳菜果样品进行扩增的图谱)共扩增出129条带，平均每条引物扩增出14.3条带，其中105条带是多态性条带，多态性条带占81.40%，说明43个广西壳菜果样品的ISSR标记存在较高的遗传多样性．引物UBC841扩增出13条带，有12条带是多态性条带，多态性最高为92.30%，引物UBC840扩增的多态性条带最少，多态性也最低，为61.54%(表2)．

表2 ISSR引物扩增位点

2.2 广西壳菜果自然种群的遗传多样性分析

4个广西壳菜果自然种群43个样品的遗传多样性分析表明(见表3)，壳菜果在物种水平上的多态位点百分率(PPB)为81.40%，表明其拥有较高的遗传多样性．在种群水平上，广西凭祥种群的最高，为69.77%；其次为广西德保和广西靖西的种群，同时为62.79%；广西那坡种群的最低，为54.26%.利用Popgene32软件分析表明4个种群总体水平上的观测等位基因数(Na)为1.845 0；有效等位基因数(Ne)为1.511 9；Nei’s基因多样性指数(H)为0.296 9；Shannon多样性指数(I)为0.440 4．对4个种群而言，Na的变化幅度为1.542 6～1.697 7；Ne的变化幅度为1.355 9～1.471 8；H的变化幅度为0.203 1～0.268 6；I的变化幅度为0.300 4～0.394 5，其变化趋势与种群位点多态性一致．说明广西壳菜果自然种群具有丰富的遗传多样性，在这4个种群中，广西凭祥种群适应环境的能力最强，其次为广西德保种群和广西靖西种群，广西那坡种群最弱．因此，广西凭祥的遗传基础最好，在将来的引种试验中建议从广西凭祥引种是比较合理的．

表3 壳菜果种群内的遗传多样性

2.3 广西壳菜果自然群落的遗传分化研究

壳菜果种群总基因多样性(Ht)为0.294 8,种群内的基因多样度(Hs)为0.243 0，种群间基因多样性等于总基因多样性减去种群内的遗传多样性，即种群间的基因多样性为0.051 8；在物种水平上有82.43%的遗传变异存在于种群内，而17.57%的遗传变异存在于种群间．各个种群之间的基因分化系数Gst为0.175 8，说明壳菜果自然种群间存在一定程度的遗传分化，但分化程度比较低．壳菜果种群间的基因流(Nm)为2.344 7，大于1，证明种群间存在一定的基因流动，足以抵制遗传漂变的作用．

2.4 遗传一致度与聚类分析

如表4所示，广西壳菜果4个自然种群之间的Nei’s遗传距离范围在0.055 8～0.138 5之间.广西德保和广西靖西2个种群之间的遗传距离最小，说明它们之间的遗传差异最小;而广西那坡种群与广西凭祥之间的遗传距离最大，为0.138 5，表明广西凭祥与广西那坡之间存在的遗传差异也最大；4个种群的遗传一致度变化范围在0.870 7～0.945 7之间，变化趋势与4个种群之间的遗传距离变化趋势一致．

表4 4个壳菜果种群间的遗传一致度和遗传距离

图2 4个壳菜果种群间遗传距离的聚类分析

根据Nei’s(1978)的遗传距离对广西壳菜果种群进行UPGMA聚类分析(见图2)，聚类结果表明：4个广西壳菜果自然种群聚为两大类，一类是广西德保和广西靖西的2个种群聚在一起，再与广西凭祥的聚在一起；广西那坡种群单独聚为一类．表明广西德保与广西靖西2个自然种群之间的亲缘关系最近，与广西那坡之间的亲缘关系最远．

3 讨论

遗传多样性是生物多样性的基本特性，是物种长期进化的结果，遗传多样性的高低对种群的生存和分布有很大影响[13]．通过ISSR分子标记技术对壳菜果遗传多样性进行分析，多态位点百分率为81.40%，比广布型植物略低，如木荷的多态位点百分率为90.02%[14]，油松的多态位点百分率为91.67%[15]，枫香的多态位点百分率为87.41%[16]，比频危植物要高，如资源冷杉的多态位点百分率为77.78%[17]．表明尽管壳菜果的多态位点百分率比广布型植物要低，但壳菜果仍处于较高水平，仍有很强的适应能力．广西壳菜果的多态位点百分率介于广布型植物和频危植物之间，可能与两方面原因有关：一是与广西壳菜果自然群落的分布状况有关，目前广西壳菜果除了在广西凭祥有大面积的天然林外，在广西其他地方很少有成片的天然林，且多集中在一些林场或者在一些自然保护区，地理距离比较远，因此壳菜果的多态位点百分率比广布型的要低；另一方面是壳菜果结实量大，种子的含油量高达36.8%[7]，种子的萌发能力比较强，发芽率在90%左右，易于植株的存活，这与Hamrick[18]提出的具有高水平遗传变异的物种寿命长、结实性高的观点一致．

广西壳菜果自然群落的遗传分化程度比较低，种群内的遗传变异占主导地位，种群间遗传变异小，这是由基因流和微环境共同作用的.基因流被视为是使种群遗传结构均质化的主要因素之一, 具有广泛基因流的物种遗传分化程度也比较小[19]．壳菜果种群间的基因流(Nm)为2.344 7，说明基因流发挥了均质化作用．种群间微生境的差异也是产生种群间遗传分化的原因之一，不同的微生境条件下存在不同的适应型，种群的基因型之间必存在相应的差异，从而产生种群间的遗传分化[20]．本研究中的壳菜果样品均来自广西,温度、水分、光照、土壤等生态因子变化较小, 微生境差异不大,不同种群所承受的生境选择压力差异比较小．但是目前很多广西壳菜果天然种群都被分割开来，种群之间相距比较远，产生了生境片段化，而生境片段化可以阻断原种群之间的基因交流[21]，降低遗传多样性，加大遗传分化程度，估计随着时间的推移，各种群之间的遗传分化将逐渐增大．

本文从分子水平对壳菜果遗传多样性的研究，有助于了解其遗传基础，为种群保护、引种栽培和生产实践提供参考依据；UPGMA聚类分析结果有助于探清壳菜果种群间的演化规律．但目前仅仅对广西壳菜果天然种群进行了研究，其他省份的壳菜果的生长状况和亲缘关系还不清楚.下一步将在全国范围内对壳菜果进行研究，除探清壳菜果天然种群间的亲缘关系外，还要探清天然林与引种地之间的差异，从分子水平上了解壳菜果是怎样对迁移地进行适应的，对引种是否成功从分子水平上作出评价．

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