免疫共沉淀结合质谱分析筛选HMGB4相互作用蛋白

王 成，赵晓蒙，帅 勇，李晓峰,刘喜枝，张晓婷，周 畅

(湖南师范大学生命科学学院，蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国 长沙 410081)

HMGB4基因是本实验室运用数字差异显示方法克隆的一个人类睾丸特异性表达新基因，属于高迁移率族蛋白(high mobility group protein，HMG)家族的一个成员[1-3]．序列分析表明，与其他3个HMGB家族成员不同,HMGB4缺乏其家族共同具有的氨基酸性尾部[4-7]．HMGB4的同源基因Hmgb4在小鼠出生两周以后在睾丸中就可以检测到，并持续到成年．但是在成熟的附睾精子中并没有表达．在睾丸的发育过程中，小鼠基因Hmgb4的表达始于粗线期精母细胞并增加直至单倍体圆形精子细胞，在精原细胞、前细线期、细线期和偶线期精母细胞没有表达[8]．

人HMGB4基因强烈、优先地在成年睾丸组织表达．Northern blot分析显示一个0.7 kb 大小的HMGB4转录本只在成人睾丸中表达，而其他7个组织(脑、心、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢)没有检测到表达．通过原位杂交和免疫组化分析显示HMGB4是一个生殖细胞特异性表达基因，在正常成年人及精原细胞瘤或隐睾症患者的睾丸中检测到阳性信号，在唯支持细胞综合征患者的睾丸中的没有检测到任何信号．利用pL8G5-Luc转录活性报告分析系统检测发现HMGB4可以大幅降低P21、AP-1的荧光素酶基因的转录，说明HMGB4是一个潜在的转录抑制子，HMGB4可能在睾丸发育和精子发生的过程中起到重要作用．

本文以HMGB4蛋白为诱饵，用HMGB4抗体在睾丸来源的多潜能畸胎瘤干细胞NTera-2细胞中进行免疫共沉淀，再采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对含HMGB4结合蛋白的复合物进行分离, 然后采用液相色谱-电喷雾串联质谱，结合数据库查询鉴定HMGB4结合蛋白,筛选细胞内与HMGB4存在相互作用的蛋白．为进一步研究睾丸来源的畸胎瘤细胞中的HMGB4蛋白聚集以及在精子发生过程所起的作用奠定基础．

1 材料和方法

1.1 材料

细胞株NTera-2由本实验室保存；胎牛血清购于美国Invitrogen公司；MEM Alpha培养基购于美国Invitrogen公司；anti-HMGB4的多克隆抗体为本实验室制备[9]；Protein A/G beads、辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔为美国Santa Cruz 公司产品；β-巯基乙醇、SDS、Tris碱、Tris-饱和酚、DTT、BSA、dNTP、丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、TEMED、PMSF、溴酚蓝.考马斯亮蓝为上海生工的进口分装试剂；DAB、过硫酸铵购自Gibco公司．碳酸氢胺、二硫苏糖醇(DTT)、铁氰化钾、 硫代硫酸钠、碘乙酰胺、三氟乙酸(TFA) 均为Sigma 公司产品；乙腈(ACN) 为国产色谱纯．

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NTera-2细胞株培养于含体积分数为10%胎牛血清的MEM Alpha培养基(添加100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素)于37 ℃、体积分数为5% CO2、90%相对湿度培养箱进行培养,生长至对数期时进行传代;细胞达到所需数量,并为对数期时, 收集细胞并计数．

1.2.2 细胞全蛋白提取 收对数生长期的NTera-2细胞(10 cm皿),加2 mL PBS洗1遍．4 mg交联剂DSP/400 μL DMSO+8 mL PBS/皿，交联30 min.PBS洗1遍，200 μL 1 mol/L Tris-Cl PH 7.5(终浓度25 μmol/L)+8 mL PBS/皿 处理15 min． PBS洗1遍，用细胞刮子收细胞到EP管中．500 g， 4 ℃离心3 min,去上清．RIPA 900 μL /皿，100×cocktail蛋白酶抑制剂稀释到1×，即9 μL/皿，冰上裂解30 min, 12 000 r/min 4 ℃离心15 min,去除细胞碎片(沉淀)，吸取上清液即为细胞总蛋白，测蛋白浓度．

1.2.3 免疫共沉淀 在2个含2 mg细胞总蛋白的抽提缓冲液中分别加入3 μg(1 μL)免疫前兔血清(对照)和3 μg(1 g/L, 3 μL)兔抗人HMGB4抗体，4 ℃转鼓4 h．各加入30 μL proteinA/G珠子，4 ℃转鼓过夜．500 g, 4 ℃离心5 min,去上清，保留珠子．RIPA裂解缓冲液洗涤含免疫复合物的珠子3次，每次5 min，离心收集珠子．加30 μL 2 ×SDS-PAGE 上样缓冲液于含protein A/G珠子的试管中, 煮沸10 min. 短暂离心后取上清用于SDS-PAGE电泳分离．

1.2.4 SDS-PAGE电泳与凝胶染色 体积分数为10%的SDS-PAGE电泳结束后,分别用考马斯亮蓝和硝酸银试剂盒进行凝胶染色．

1.2.5 蛋白质酶解 根据凝胶染色结果,比较实验组和对照组的蛋白条带, 从胶中切取分辨较好的蛋白质带, 置于15 mL Eppendorf 管中,对经两种染色的蛋白质带分别进行脱色、还原、烷基化、酶解、萃取和脱盐等处理．

1.2.6 质谱分析和数据库查询 质谱分析在德国 Bruker 公司的 HCT Ultra 质谱仪上进行．质谱分析前的色谱分离在 Agilent1200上进行．流动相A液为含0.1%(体积分数，下同) HCOOH的水溶液，B 液为含0.1% HCOOH的ACN，C液为含0.1% HCOOH的水溶液．流速 3 μL/min．样品在预柱中用 C液脱盐后，分析柱用以下梯度进行梯度洗脱：5～65 min ACN体积分数从 5%上升至 40%，65～85 min ACN体积分数保持在 85%，梯度洗脱完成后，重新平衡分析柱．色谱洗脱的肽片段进入质谱离子源后进行一级质谱(MS)和串级质谱(MS/MS)分析,正离子检测模式，喷嘴电压10 PSI，氮气流速为5 μL/min，干燥气体温度为 300 ℃，毛细管电压为 4 000 V． MS 和 MS/MS 的转换通过仪器控制软件中的Automated Data Dependent Acquisition(DDA)模式控制．满足设定条件的一级离子进行串级分析． 整个质谱系统控制和原始数据采集由 Esquire Control TM(6.0)软件完成．原始质谱数据由Data Analysis 软件处理成mgf 格式的文件．将这些文件输入数据库IPI(3.28 版本加上相应的反转序列数据库),使用 Mascot 软件(Matrix Science Ltd.,UK)中的串级质谱数据搜索功能(MS/MS Ions Search)进行搜索．

2 结果

2.1 免疫共沉淀所得蛋白质的SDS-PAGE分析

抗HMGB4抗体与人畸胎瘤细胞NTera-2细胞总蛋白进行免疫共沉淀，收集的免疫共沉淀蛋白复合物进行SDS-PAGE分离，经考马斯亮蓝染色和硝酸银染色后结果如图1所示.与对照组相比，检测到5条差异条带，这些差异条带很可能是HMGB4结合蛋白条带，其相对分子质量分别为18 000、 40 000 、35 000、30 000、 18 000左右．

A 图为考马斯亮蓝染色结果;B 图为硝酸银染色结果.Marker为蛋白分子质量标准(A图为Fermentas SM0431,B图为Fermentas SM0671),Control为免疫前兔血清做的免疫沉淀产物作为对照，anti-HMGB4为HMGB4多抗做的免疫沉底产物；箭头表示差异条带．图1 用HMGB4抗体对NTera-2全蛋白进行免疫共沉淀的SDS-PAGE考染(A)和银染(B)图谱

2.2 质谱分析

从SDS-PAGE电泳凝胶中分别切取图1中有差异的5条蛋白质条带，经过脱色、还原、烷基化、酶解、萃取等处理，制备好的样品使用德国 Bruker 公司的 HCT Ultra 质谱仪进行质谱分析,图2为差异蛋白的HCT Ultra-MS质谱图．图中横坐标为打分的阈值，阴影部分外的表示得分高出阈值的及可信蛋白，阴影部分以内的表示得分在阈值以下的及不可信蛋白.此次获得的质谱数据以得分为50分以上的作为可信蛋白．

图2 差异蛋白的HCT Ultra-MS质谱图

2.3 数据库搜索结果

获得的原始质谱数据由Data Analysis 软件处理成mgf 格式的文件．将这些文件输入数据库IPI(3.28 版本加上相应的反转序列数据库),使用 Mascot 软件(Matrix Science Ltd.,UK)中的串级质谱数据搜索功能(MS/MS Ions Search)进行搜索鉴定．分析得到5个与HMGB4相互作用的蛋白(表1)，分别是Pdha1、Keratin 6B、Keratin 5、Actb Actin Cytoplasmic 1、RPL18．

表1 HMGB4免疫共沉淀产物质谱鉴定的有效相互作用蛋白质

3 讨论

HMGB4是一个生殖细胞特异性表达的基因,在正常成年人及精原细胞瘤或隐睾症患者的睾丸中都能检测到阳性信号．它在睾丸中和哪些蛋白相互作用，是研究其功能的重要途径．本文应用免疫共沉淀与质谱分析相结合的方法，从生殖细胞起源的人畸胎瘤细胞NTera-2细胞中鉴定了5个HMGB4结合蛋白，分别是Pdha1、Keratin 6B、Keratin 5、Actb Actin Cytoplasmic 1、RPL18,鉴定的5个蛋白是文献中未见报道的新HMGB4结合蛋白．

在这5个蛋白中，丙酮酸脱氢酶E1a亚单位(PDHA1)蛋白相对其他4个蛋白被研究报道较多，其结构、功能等都有很多相关报道．PDHA1属于丙酮酸脱氢酶系中的成员[10]，它位于X染色体短臂,含有保守的硫辛酸焦磷酸盐结合区．丙酮酸脱氢酶系是一种催化丙酮酸脱羧反应的多酶复合体，由丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸转乙酰基酶、二氢硫辛酸脱氢酶和6种辅助因子(焦磷酸硫胺素、硫辛酸、FAD、NAD、CoA和Mg离子)组成[11]．丙酮酸脱氢酶复合物位于线粒体基质中[12],是连接糖酵解和三羧酸循环的枢纽,催化丙酮酸不可逆地转化成乙酰辅酶A，并把糖酵解与三羧酸循环以及ATP的生成紧密地联系在一起．这一重要反应对于需要大量ATP的组织(如大脑、肌肉)来说至关重要．目前的研究表明，PDHA1基因缺陷可导致丙酮酸脱氢酶复合物活性下降,丙酮酸代谢障碍,引起乳酸酸中毒、神经肌肉损害等一系列复杂的临床表现[13-16]．在睾丸来源的NTera-2细胞中，HMGB4可以和PDHA1结合，但HMGB4与PDHA1基因的相互作用方式及其生理功能，目前还不清楚．这也是作者下一步的一个研究重点．

本文首次在睾丸来源的畸胎瘤细胞中鉴定了5个HMGB4蛋白，它们和HMGB4相互作用的生物学意义仍然须做深入的探索和实验验证，但为阐明在睾丸中HMGB4蛋白聚集及生理功能的研究提供了新的线索．

参考文献：

[1] VYDRA N, MALUSECKA E, JARZAB M,etal. Spermatocyte-specific expression of constitutively active heat shock factor 1 induces HSP70i-resistant apoptosis in male germ cells[J]. Cell Death Differ, 2005,13(2):212-222.

[2] DE YOUNG M P, DAMANIA H, SCHEURLE D,etal. Bioinformatics-based discovery of a novel factor with apparent specificity to colon cancer[J]. In Vivo, 2002,16(4):239-248.

[3] GOODWIN G H, SANDERS C, JOHNS E W. A new group of chromatin-associated proteins with a high content of acidic and basic amino acids[J]. Eur J Biochem, 1973,38(1):14-19.

[4] BUSTIN M. Revised nomenclature for high mobility group (HMG) chromosomal proteins[J]. Trends Biochem Sci, 2001, 26(3):152-153.

[5] BIANCHI M E, AGRESTI A. HMG proteins: dynamic players in gene regulation and differentiation[J]. Curr Opin Genet Dev, 2005, 15(5):496-506.

[6] LANDSMAN D, BUSTIN M. A signature for the HMG-1 box DNA-binding proteins[J]. Bioessays, 1993,15(8):539-546.

[7] STOTT K, TANG G S, LEE K B,etal. Structure of a complex of tandem HMG boxes and DNA[J]. J Mol Biol, 2006,360(1):90-104.

[8] CATENA R, ESCOFFIER E, CARON C,etal. HMGB4, a novel member of the HMGB family, is preferentially expressed in the mouse testis and localizes to the basal pole of elongating spermatids[J]. Biol Reprod, 2009,80(2):358-366.

[9] 易 朵,王 成,帅 勇,等.高迁移率族蛋白HMGB4的表达及多克隆抗体制备[J].湖南师范大学自然科学学报, 2011,34(2):65-70.

[10] MUNNICH A, RTIG A, CORMIER2DAIRE V,etal. Clinical presentation of respiratory chain deficiency[M]//SCRIVER C R, BEAUDET A L,SLY W S,etal. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York:Mc Graw-Hill, 2001:2261-2274.

[11] SMEITINK J L, HEUVEL L, DIMAURO S. The genetics and pathology of oxidative phosphorylation[J]. Nat Rev Genet, 2001, 2(5):342-352.

[12] 张 尧,杨艳玲,秦 炯. 丙酮酸脱氢酶复合物缺陷与疾病[J]. 临床儿科杂志, 2007, 24 (12):956-958.

[13] LISSENS W, MEIRLEIR L, SENECA S,etal. Mutations in the X-linked pyruvate dehydrogenase (E1)αsubunit gene (PDHA1) in patients with a pyruvate dehydrogenase complex deficiency[J]. Hum Mutat, 2000, 15(3):209-219.

[14] ZEVIANI M, TARONI F. Mitochondrial diseases[J]. Baillieres Clin Neurol, 1994, 3(2):315-334.

[15] 孙 芳, 戚 豫, 王 丽, 等. Leigh 综合症的临床和分子遗传学研究进展[J]. 中国当代儿科杂志,2005, 7( 2):186-189.

[16] BROWN R M, DAHL H, BROWN G K. X-chromosome localization of the functional gene for the E1 alpha subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex[J]. Genomics, 1989, 4 (2):174-181.