银杏果多糖树脂脱色工艺

2012-11-21杨强李新华林子木

食品与发酵工业 2012年12期

杨强，李新华，林子木

1(沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳，110866)2(辽宁省粮食科学研究所，辽宁沈阳，110032)

银杏是世界上十分珍贵和古老的树种之一，有“活化石”之美称。我国园艺学家们也常常把银杏与牡丹、兰花相提并论，誉为"园林三宝"。银杏果是银杏树的种子，因其中种皮为白色的硬壳，故俗称白果［1］。银杏果中含有丰富的营养成分和特异的化学物质，多糖就是银杏果中一种重要的活性成分。近年来研究发现，多糖具有免疫调节、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、降血糖等多种活性作用。但除蛋白后的银杏果多糖色泽呈橘黄色，其色泽不仅会影响到多糖的纯度，还会影响到多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性的研究。因此，对银杏果多糖进行脱色，不仅能改善多糖的外观，而且还能为深入研究其结构等打下基础［2］。本文探讨了离子交换树脂和大孔吸附树脂对银杏果多糖的脱色情况，采用静态吸附和动态吸附试验确定了树脂的种类，优化了脱色工艺，取得了较好的效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

银杏果多糖(实验室提取);脱色1号、D900、D101、HD-8、NKA9、DA-201、AB-8、S-8 型大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)。

1.2 仪器设备

7200 型分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);JD200-2型电子天平(北京塞多利斯仪器有限公司);数显式恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DZF-6050真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);HL-2恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 树脂的预处理

阳离子交换树脂→质量分数5%NaCl浸泡20 h→去离子水清洗至中性→质量分数5%NaOH浸泡4 h→去离子水冲洗至中性质量分数5%HCl浸泡4 h→去离子水冲洗至中性→烘箱中50℃烘干备用。

阴离子交换树脂→质量分数5%NaCl浸泡20 h→去离子水清洗至中性→质量分数5%HCL浸泡4 h→去离子水冲洗至中性→质量分数5%NaOH浸泡4 h→去离子水冲洗至中性→烘箱中50℃烘干备用。

吸附树脂→质量分数5%HCl浸泡20 h→去离子水清洗至中性→质量分数5%NaOH浸泡4 h→去离子水冲洗至中性→质量分数95%乙醇浸泡12 h→去离子水清洗至无醇味→烘箱中50℃烘干备用。

1.3.2 静态吸附实验

1.3.2.1 大孔树脂脱色方法

取一定量处理好的树脂，加入30 mL 2%的银杏果多糖溶液于100 mL三角瓶中，恒温振荡2 h(120 r/min)。振荡结束后，双层滤纸过滤，5000 r/min离心20 min，考察不同树脂对多糖溶液的脱色率、总糖保留率和蛋白质去除率。

1.3.2.2 正交实验

100 mL三角瓶中分别加入30 mL 2%的pH值为4.5、5.5和6.5的银杏果多糖溶液和一定量处理好的脱色1号、D900和D101树脂，然后将三角瓶置于25、35、45℃的恒温振荡箱中振荡2 h(120 r/min)，振荡结束后，滤纸过滤多糖溶液，溶液经5 000 r/min离心20 min后，考察不同树脂对提取液的脱色率、总糖保留率和蛋白质去除率。

1.3.3 动态吸附实验

1.3.3.1 上柱速度对脱色效果的影响

装柱体积1BV，配制2 mg/mL的脱蛋白后的多糖溶液 1BV 上样，选择上样速度为0.5，l，1.5，2.0，2.5 mL/min，再用2BV的蒸馏水淋洗，合并多糖脱色液和洗脱液，分别测其多糖、色素、蛋白质的含量，考察上样流速对吸附效果的影响。

1.3.3.2 上样浓度对脱色效果的影响

装柱体积1BV，分别称量1 g粗多糖配成1、2、3、4、5、6 mg/mL的粗多糖溶液上柱，流速为1.5 mL/min，后用2BV的蒸馏水冲洗，合并多糖脱色液和洗脱液，分别测其多糖、色素、蛋白质的含量，考察上样浓度对吸附效果的影响。

1.3.3.3 柱容量对脱色效果的影响

在上柱速度为1.5 mL/min，上柱浓度为4 mg/mL条件下，考察脱色1号的柱容量。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 多糖测定及保留率的计算

采用苯酚-硫酸法［3］，以葡萄糖为对照品。线性回归方程为:A=13.961c+0.0449，相关系数 r=0.999。式中:A为吸光度;c为以葡萄糖计的多糖浓度(mg/mL)。

式中:m前、m后分别为脱色前后的多糖总量。

1.3.4.2 脱色率测定及计算方法

经脱色后的待测的多糖提取液双层滤纸过滤，5 000 r/min 离心20 min 后，分别在420、520、620 nm处测其的吸光值。

式中:OD总前、OD总后分别为脱色前后溶液在420、520、620 nm处测得的吸光值的和。

1.3.4.3 蛋白质的测定及去除率的计算

蛋白质测定采用考马斯亮蓝G-250法［4］测定，以牛血清白蛋白为标准品，线性回归方程为A=0.042 82+0.001 34c，相关系数 r=0.997 5。

式中:A为吸光度;c蛋白质浓度(μg/mL)。

式中:c前、c后分别为脱色前和脱色后蛋白质的浓度。

2 结果与分析

2.1 静态吸附法筛选树脂实验结果

2.1.1 树脂的初步筛选

分别向三角瓶中加入8种一定量的树脂和料液(30 mL)，然后放入摇床振荡2 h(温度45℃，转速120 r/m in)。脱色后，滤纸过滤多糖溶液，5 000 r/min离心20 min，测定并计算料液的脱色率、总糖保留率和蛋白质去除率，结果如表所示。

由表1可知，脱色1号、D900、DA-201C、D101四种树脂的脱色率都在50%以上，多糖保留率也在65%以上，但 D101树脂的蛋白质去除率却只有51.07%，所以选择脱色1号、D900、DA-201C树脂进行正交试验，对树脂脱色条件进一步优化。

以上8种被考察的树脂对色素、多糖、蛋白质的吸附各不相同，这与树脂的性能和被吸附物质的性质有很大的关系。从树脂性质上看，树脂脱色1号、D900属于阴离子交换树脂，树脂HD-8属于阳离子交换树脂，树脂脱色1号、D900的脱色效果优于树脂HD-8，表明银杏果多糖提取液中的色素可能属于阴离子型。从树脂极性来看，树脂D101、DA-201为非极性树脂，树脂AB-8、S-8、NKA-9为极性树脂，树脂D101、DA-201的脱色效果明显优于树脂AB-8、S-8、NKA-9，表明银杏果多糖提取液中的色素可能属于非极性分子。此外，树脂聚合体所具有的网眼大小必须与银杏果多糖中所含色素分子的大小相适应，才能达到吸附效果，而脱色效果较差的树脂NKA-9孔径最大，由此推测银杏果多糖溶液中色素主要为小分子。综合分析银杏果多糖提取液中的色素可能以带负电荷的非极性小分子色素为主。

2.1.2 正交设计确定脱色的最佳工艺条件

采用正交试验法确定银杏果多糖溶液的最佳脱色条件，设计三因素三水平L9(33)正交试验表，见表2。

表2 试验因素水平表L9(33)

表3 正交试验结果表

由表3可知，影响多糖脱色率的因素依次为A＞B＞C，即树脂种类＞pH值＞温度，最优组合为A1B1C2，即树脂种类为脱色1号，pH值为4.5，温度为35℃;影响多糖保存率的因素依次为A＞C＞B，即树脂种类＞温度＞pH值，最优组合为A1B1C3，即树脂种类为脱色1号，pH值为4.5温度为45℃;影响蛋白去除率的因素依次为A＞B＞C，即树脂种类＞pH值＞温度，最优组合为A1B3C1，即树脂种类为脱色1号，pH值为6.5，温度为25℃。

综合考虑脱色率、总糖保留率、蛋白质去除率3个指标，得出最佳脱色条件为:脱色1号树脂、pH值为4.5、温度为25℃。

2.2 动态吸附实验结果

2.2.1 上柱速度对脱色效果的影响

将浓度为2.0 mg/mL的银杏果多糖溶液以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 的流速分别上样，然后测其脱色率，结果见图1。

图1 上样速度对树脂脱色的影响

由图1可知，随着上柱速度的增加，多糖的脱色率逐渐下降。当上样速度为0.5、1.0 mL/min时，脱色率非常高;当上样速度为2.0 mL/min时，脱色率明显下降。从吸附理论可以解释，流速越慢，有利于上柱液中色素分子与树脂表面充分进行粒扩散和膜扩散，使色素分子充分被树脂吸附;同时，流速过快，树脂与多糖溶液接触的时间越短，不能充分吸附其中色素，因而脱色效果较差。因此选择上柱速度为1.5 mL/min。

2.2.2 上样浓度对脱色效果的影响

配制浓度为 1，2，3，4，5，6 mg/mL 的银杏果多糖溶液分别上样，然后测其脱色率，结果见图2。