毛细管气相色谱内标法同时测定奶粉中亚麻酸、ARA、EPA和DHA

黄杰，余孔捷，钱疆，王丹红，蔡姗姗，薛芝敏

(福建出入境检验检疫局，福建福州，350001)

研究表明，亚麻酸、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是必需脂肪酸，具有多种保健功效，DHA更被称为“脑黄金”，厂家在婴幼儿奶粉中添加亚麻酸、ARA和DHA成为了商品卖点。由于这些脂肪酸在食品中含量低，化学性质不稳定，对测定方法的准确性和重现性提出了更高的要求。现行国标方法尚无内标法［1］。以往文献中有使用十七烷酸甲酯为内标物［2－3］，缺点是奶粉中含有该成分［4］，其色谱峰位置与被测组分相距较远;有使用三苯乙烯为内标物［5］，缺点是其为有毒有害物质，理化性质与被测组分完全不同。二十一烷酸甲酯则基本符合内标物的理想条件，为此本研究建立了气相色谱内标法，可同时测定奶粉中亚麻酸、ARA、EPA和DHA含量，结果准确、重现性好。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱仪，Agilent 6890N(配FID检测器);分析天平，上海梅特勒-托利多公司 AE240型(精度0.000 01 g)。

亚麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA和二十一烷酸等甲酯标准品，上海安谱科学有限公司，平时置于4℃冰箱保存，临用时配制标准溶液;亚麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA等甲酯标准溶液根据需要浓度用正庚烷为溶剂配制;二十一烷酸甲酯内标溶液(2.039 mg/mL)，用甲苯为溶剂配制;氢氧化钾-甲醇溶液(2 mol/L)，用甲醇为溶剂配制。正庚烷、甲苯、甲醇、氢氧化钾均为AR级。

1.2 试样及其前处理

奶粉应密封冷藏。检测时准确称取试样1.500 g于50 mL棕色容量瓶内，准确加入1.00 mL内标溶液，摇匀，再加入4 mL正庚烷，摇匀。

甲酯化处理:于上述棕色容量瓶内加入5 mL氢氧化钾-甲醇溶液，室温下不断摇匀20 min，再加入蒸馏水使液面接近容量瓶口，加塞静置约1 min分层后，加入2滴无水乙醇于液面，加塞并以封口胶膜密闭，于冰箱内静置过夜，取上清液为测试液供气相色谱仪检测。

选用各种品牌奶粉6份，密封罐装商品。按本法测定，每份平行3次，计算平均值及标准差。

1.3 色谱分析条件

CP-Sil88FAME石英毛细管柱，100 m×0.25 mm×0.20 μm;载气，高纯氮气(99.999%);柱温，采用程序升温:初始温度140℃，保持5 min，再以2℃/min速率，升温至220℃，保持13 min;进样口温度为250℃，压力为160 kPa，分流比为30∶1;检测器温度为280℃，氢气为40 mL/min，空气为300 mL/min。进样量为 1 μL。

1.4 线性试验

根据国家标准对婴幼儿配方奶粉的要求［6］及奶粉样品的实际检测结果，配制不同浓度范围的4种被测组分及内标物混合标准溶液(详见表1)。准确吸取5 mL混合标准溶液于50 mL棕色容量瓶，进行甲酯化处理，制得测试液;平行试验3份。测定值取平均值，计算线性回归方程、相关系数、相对校正因子;根据色谱基线信噪比S/N=3计算检出限。

1.5 回收试验

选用低含量亚麻酸、不含ARA、EPA和DHA的奶粉样品进行试验。加标组:称取试样1.500 0 g于50 mL棕色容量瓶，准确加入1 mL内标溶液;分别准确加入4种标准溶液各1 mL(添加量详见表3)，摇匀后，进行甲酯化处理、制得测试液;平行试验6份。试样组:步骤同“加标组”，但不加入4种标准溶液，加入4 mL正庚烷。根据加标组和试样组的测定值，计算回收率和变异系数(CV)。

1.6 结果计算

根据某标准溶液及内标溶液浓度和用量及其色谱峰面积，计算某标准物质与内标物的相对校正因子fi:

式中Ms和As为某标准溶液中某标准物质的质量(mg)及其峰面积;Mi和Ai为某标准溶液中内标物的质量(mg)及其峰面积。

根据测试液中某被测组分色谱峰面积及内标溶液浓度和用量及其色谱峰面积，计算试样中某被测组分含量X，计算公式为:

式中:Mci和Aci为测试液中内标物的质量(mg)和色谱峰面积;Ac为测试液中某被测组分的色谱峰面积;M为试样称取量(g);测定值应由脂肪酸甲酯转换为脂肪酸，故乘以系数Q1，再由脂肪酸转换为脂肪酸甘油三酯，故除以系数 Q2(亚麻酸的 Q1为0.952 0，Q2为0.956 0;ARA 的 Q1为 0.956 0，Q2为0.959 7;EPA 的 Q1为0.955 7，Q2为0.959 2;DHA的 Q1为 0.959 0，Q2为 0.962 4)［1］。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理、检测结果及其色谱图

内标溶液使用甲苯为溶剂，目的是提高溶脂效果，这与国标方法［1］相一致。使用棕色容量瓶做甲酯化反应容器的优点:1是避光;2是样液与试剂约10 mL混合液在50 mL容量瓶内易于反复摇匀，使之反应充分，避免水浴加热，降低热分解作用;3是加入蒸馏水后，使上层有机相进入细窄瓶颈，有利于两相分离，同时使液面接近瓶口，减小瓶内上层液面与瓶塞之间的空间，降低氧气分解作用，可不需充氮气。滴加乙醇有加速上层有机相澄清的作用。

通常天然奶源的奶粉含有少量亚麻酸，而ARA、EPA和DHA含量极微，因而把亚麻酸、ARA、EPA和DHA作为营养强化剂加入奶粉中，生产出婴儿配方、幼儿配方等多种奶粉，其中以添加ARA和DHA价值最高，表1列出了各种奶粉的测定结果。

表1 各种奶粉样品的测定结果(n=3)

图1为婴儿配方奶粉样品色谱图、图2为幼儿配方奶粉样品色谱图，C18∶3为亚麻酸、C21∶0为内标物、C20∶4为 ARA、C20∶5为 EPA、C22∶6为 DHA。图1 中各脂肪酸分离良好，内标物色谱峰与被测组分的色谱峰位置较近。若使用十七烷酸甲酯为内标物，其色谱峰在30 min位置，与被测组分相距较远;如使用二十三烷酸甲酯为内标物，色谱峰位置离ARA、EPA和DHA更近，但与二十碳三烯酸和二十二碳一烯酸的色谱峰难以分开;如使用二十四烷酸甲酯为内标物则与EPA的色谱峰难以分开。因此二十一烷酸甲酯是较理想的内标物，其分子结构、理化性质与被测组分相似，奶粉通常不含该物质，互不干扰，而且化学性质稳定，标准物质易购，纯度有保证，做内标物使用，可以克服多不饱和脂肪酸标准物质易氧化、不易保存，价格昂贵的缺点。

2.2 线性范围及检出限

图1 进口B婴儿配方奶粉色谱图

在测定浓度围内，FID响应值与被测组分及内标物浓度的线性关系良好，相关系数均在0.998以上。4种被测组分的相关试验数据见表2。根据色谱基线信噪比，计算出4种被测组分的检出限;按本方法取样量1.500 g及加入甲苯1 mL、正庚烷4 mL用量，以表2检出限最大值0.003 mg/mL计算，试样的检出限为0.010 mg/g即1.0 mg/100 g，基本满足国标方法［1］的要求。

图2 进口C幼儿配方奶粉色谱图

表2 线性测定与检出限试验结果(n=3)

2.3 回收率与重现性

由表3可见，4种被测组分的回收率为95.4%～104.7%，试样组和加标组的变异系数为2.168%～4.368%，表明本方法的准确性、精密度均良好。应注意的是，由于试样中DHA、EPA、ARA和亚麻酸的含量通常较低，在使用仪器软件平台对被测组分色谱峰面积进行计算时，如采用自动积分模式计算，可能导致检测数据变化较大，建议采用手动积分模式计算。

表3 回收率和精密度试验结果(n=6)

3 结论

目前进口婴幼儿奶粉占据国内大部分市场，其品牌多、种类杂，品质参差不齐。检测亚麻酸、ARA、EPA和DHA含量是评价婴幼儿奶粉品质优劣的重要指标，本研究建立的以二十一烷酸甲酯为内标物的气相色谱法，可同时测定奶粉中亚麻酸、ARA、EPA和DHA含量，结果准确，重现性好，为食品安全监管、保护消费者权益提供了可靠的检测方法。

［1］中华人民共和国国家标准［S］.GB 5413.27－2010.

［2］张凤枰，索有瑞，赵先恩，等.毛细管气相色谱内标法测定核桃油中的脂肪酸［J］.天然产物研究与开发，2007，19:262－267.

［3］王映强，赖炳森，颜晓林，等.气相色谱法测定紫苏子油中α-亚麻酸的含量［J］.中国生物药物杂志，1998，19(2):91－92.

［4］刘梅森，何唯平，赖敬财，等.奶粉脂肪酸与乳制品风味关系研究［J］.中国乳品工业，2008，36(2):13－15.

［5］吴伟都，金世梅，朱慧，等.气相色谱内标法测定奶粉及乳饮料中的DHA和EPA［J］.中国食品添加剂，2005(1):106－108.

［6］GB10767－2010.较大婴儿和幼儿配方食品［S］.