高效液相色谱法测定养肝清降丸中大黄酚的含量

2012-11-21杨晋霞樊宁宁梁晋伟

山西卫生健康职业学院学报 2012年1期

杨晋霞，樊宁宁，龚娇，梁晋伟

(1.太原市小店区人民医院，山西太原 030032;2.山西医科大学，山西太原 030001)

养肝清降丸由决明子、枸杞子、熟地黄等十六味药材组成，具有滋养肝肾的功效，适用于肝肾阴虚型的视力减弱患者。决明子为其主要成分，现代药理学研究表明［1～3］，决明子能清肝热，润肠燥，又有平肝养肾之功，用于目赤肿痛，大便秘结，头痛、头晕，青盲内障。为了建立中药新制剂养肝清降丸含量测定标准，保证产品质量的稳定可靠，进一步提高制药水平，本研究采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatogoraphy，HPLC)对处方中决明子的主要成分大黄酚进行定量分析，取得满意结果，为养肝清降丸质量标准的制定提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪，配DAD检测器;日本岛津UV-2450型可见紫外分光光度计。

1.2 药品及试剂

大黄酚对照品:批号111562-200605，购于中国药品生物制品检定所;养肝清降丸供试品:批号20100812，20100915，20101026，山西医科大学药学院制剂室提供。乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［4～6］

2.1.1 色谱柱采用日本资生堂Capcell PAK ODS C18(250 mm ×4.6 mm，粒径5 μm)。

2.1.2 流动相甲醇－0.1%磷酸溶液(79∶21)。

2.1.3 检测波长取大黄酚对照品溶液，在200～400 nm波长之间进行紫外扫描，以254 nm为检测波长。见图1。

图1 大黄酚对照品光谱图Fig 1 Spectrogram of Control Products of Chrysophanol

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液配制大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 μg的溶液，摇匀即得。

2.2.2 供试品溶液配制取重量差异项下的本品，剪碎，取约18 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，置水浴上加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，蒸干，加10%盐酸溶液30 mL，置水浴中加热水解1 h，立即冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液配制取处方除决明子外的全部药味，按成品工艺及供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.3 干扰实验

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液各10 μL，注入液相色谱仪，进行测定。见图2。结果表明:阴性样品在大黄酚保留时间处，无其他成份干扰，方法的专属性良好。

2.4 线性范围考察

精密称取大黄酚对照品适量，加甲醇制成110 μg/mL的溶液，分别量取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL至10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，分别进样10 μL，即进样量为 0.11 μg、0.22 μg、0.33 μg、0.44 μg、0.55 μg，测定峰面积为 181.166、699.466、1 304.219、1 902.693、2 520.488。以大黄酚进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。见图3。其回归方程为Y=5 347.2X －442.95，r=0.999。结果表明，大黄酚在0.11～0.55 μg范围内，峰面积与进样量之间呈良好线性关系。

图2 干扰试验图谱Fig 2 Atlas of Interference Experiments

图3 线性回归方程图Fig 3 Equation Graph of Linear Regression

2.5 精密度实验

精密吸取同一份供试品溶液(批号:20100812)，重复进样 6 次，峰面积分别为2 249.840、2 259.426、2 258.516、2 263.215、2 267.744、和2 273.260，RSD为0.4%。结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

取同一份供试品溶液(批号:20100812)，分别在制备后及2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后依法测定大黄酚的峰面积，结果为 2 293.339、2 306.373、2 301.181、2 301.358、2 301.065和2 337.073，RSD 为 0.7%。结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性实验

取同批样品(批号:20100812)，依法平行制备6份供试品，分别测定大黄酚的含量，结果为0.067 4 mg/g、0.067 5 mg/g、0.067 3 mg/g、0.067 3 mg/g、0.067 4 mg/g和0.068 5 mg/g，平均含量为 0.067 6 mg/g，RSD 为0.05%。结果表明该方法的重复性良好。

2.8 回收率实验

采用加样回收方法，取已知含量的样品(批号:20100812，0.0676mg/g)适量，精密称定，分别加入一定量的大黄酚对照品，按供试品溶液配制方法制备三种不同添加浓度的回收率样品溶液，照2.1项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。结果表明该方法具有良好的回收率。

表1 回收率测定结果Table 1 Determination Results of the Recovery Rate

2.9 决明子药材的测定

精密称取决明子药材0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，按供试品溶液配制方法配制决明子药材测定溶液。再按文中的供试品含量测定条件进行实验，结果均符合药典要求的药材含量限度。结果见表2。

表2 药材测定结果Table 2 Determination Results of Medicinal Materials

2.10 样品测定

分别取3批样品，按本文色谱条件进行含量测定，结果见表3。

表3 3批样品测定结果Table 3 Determination Results of Three Batches of Samples

3 讨论

3.1 流动相的选择

实验中对流动相的比例进行了调整，以甲醇－0.1%磷酸溶液(85∶15)为流动相，结果分离效果较差，分离不完全;以甲醇－0.1%磷酸溶液(82∶18)为流动相，结果供试品主峰与杂质峰分离不完全;以甲醇－0.1%磷酸溶液(79∶21)为流动相，结果分离效果较佳，保留时间适宜，分离度大于1.5，因此选择甲醇－0.1%磷酸溶液(79∶21)为流动相。