固相萃取－高效液相色谱手性流动相添加剂法测定血浆中氧氟沙星对映体

王乃毅，白小红

(1.山西职工医学院，山西太原 030012;2.山西医科大学，山西 太原 030001)

氧氟沙星(ofloxacin，OFLX)是20世纪80年代合成的4－氟喹诺酮类药，它对革兰氏阴性杆菌有强大杀菌作用，口服吸收好，体内分布广，不良反应少，对多种感染有良好的疗效。而氧氟沙星是外消旋体，含左旋氧氟沙星(S－(－)－OFLX)与右旋氧氟沙星(R－(+)－OFLX)。其中，左旋氧氟沙星的抗菌活性是右旋氧氟沙星的8～126倍。因此血浆中氧氟沙星的拆分对临床安全用药有重要意义。色谱分离手性药物的方法有手性试剂衍生化(CDR)法，手性流动相添加剂(CMPA)法和手性固定相(CSP)法。由于其中的CMPA法［1］可采用普通的色谱柱，手性添加剂可以流出，也可更换，同时添加物的选择范围扩大。许多科研人员采用该法分离手性对映体［2～5］。刘学斌等［6］以甲醇－异亮氨酸手性溶液(取L－异亮氨酸1.04 g和硫酸铜1.0 g溶于1 000 mL水中)(17∶83，V∶V)为流动相，拆分优利沙星对映体，取得了较好的结果。本实验参考该条件对血浆中的氧氟沙星对映体进行了分离与测定。

生物样品的预处理是体内药物分析的关键，固相萃取技术萃取效率高，重现性好，杂质干扰极低，无乳化现象［7］。它可以从生物样品中提取净化微量药物，被广泛用于生物样品的检测中。本实验采用C18固相萃取小柱萃取血浆中的氧氟沙星，然后用高效液相色谱法 (high performanceliquid chromatogoraphy，HPLC)测定氧氟沙星对映体含量，结果更可靠，灵敏度更高。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

日本岛津高效液相色谱仪(Shimadzu，LC-10ATVPLiquid Chromatograph，CTO-10A Column Oven，RF-10AXLFluorescence Detector)，20 μL定量进样环，AccuBOND C18固相萃取小柱(100 mg/mL，安捷伦公司)，N-2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所)，800型离心沉淀器(上海手术器械厂)，XW-80A型混旋器(上海医科大学仪器厂)。

氧氟沙星标准品(中国药品生物制品检定所)，奥复星(0.2%氧氟沙星注射液，北京双鹤药业股份有限公司 0401072)，L－异亮氨酸(C6H13NO2，Bio Basic Tnc.1009S03)，CuSO4·5H2O，北京化工厂)，血浆(太原市红十字血液中心)，其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 氧氟沙星标准溶液:精密称取氧氟沙星标准品适量，用水溶解稀释配成500 μg/mL的标准贮备液，冰箱内4℃保存。内标溶液:精密称取环丙沙星原料药适量，用水溶解稀释配成200 μg/mL的标准贮备液，于冰箱内4℃保存。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:ODS-BP柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，中国大连依利特公司);流动相:含1.31 g/L异亮氨酸和0.80 g/L硫酸铜的水溶液－甲醇(81.5∶18.5，V/V)，pH 3.3;流速:0.8 mL/min;激发波长:330 nm，发射波长:504 nm;柱温:40℃;进样量:20 μL。

1.3 血浆样品预处理

将固相萃取小柱依次用1 mL甲醇和1 mL水活化。移取0.5 mL血浆加入已活化的固相萃取小柱中，将小柱在离心机中以1 500 r/min离心2 min，用1 mL 20%的甲醇溶液冲洗小柱，再以1 500 r/min离心2 min，后用1 mL 100%的甲醇溶液冲洗小柱，以1 500 r/min离心2 min，收集最后一次甲醇洗脱液，在60℃水浴氮气气流下吹干，加100 μL流动相溶解残渣，在旋涡混合仪上混匀2 min，取20 μL进样。

2 结果

2.1 色谱行为

在上述色谱条件下，对映体可以良好分离，分离度达到1.5以上，血浆中内源性物质对氧氟沙星的拆分无干扰。色谱图见图1。

2.2 工作曲线

分别精密移取空白血浆0.5 mL，置8支10 mL具塞试管中，分别加入不同浓度的氧氟沙星标准溶液0.2 mL，再分别加入内标环丙沙星溶液0.3 mL、水4.0 mL稀释，使每管含氧氟沙星分别为0.08 μg/mL、0.2 μg/mL、 0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、 1.0 μg/mL、4.0 μg/mL、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL，含环丙沙星均为12 μg/mL。然后各取0.5 mL，按照 1.3 步骤对样品进行处理和色谱分析，分别以左、右旋氧氟沙星峰面积与环丙沙星(内标物)峰面积之比(Y)、(Y')对氧氟沙星浓度(X)进行线性回归。线性方程分别为 :左旋氧氟沙星Y=–0.104+0.466X(r=0.994 5)，右旋氧氟沙星 Y'=–0.146+0.504X(r=0.994 7)。

2.3 检测限

当信噪比S/N=3时，血浆中的左、右氧氟沙星的最低检测浓度均为4 ng/mL。

图1 氧氟沙星血浆样品色谱图Fig 1 Chromatogram of Plasma Samples of OFLX

2.4 回收率实验

2.4.1 萃取回收率 分别配制氧氟沙星浓度为0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、20.0 μg/mL的血浆样品，均取0.5 mL加入固相萃取小柱，按1.3项操作，待挥干溶剂后，用内标环丙沙星溶液(12 μg/mL)0.5 mL溶解残渣，进样分析，得到药物与内标峰面积比。另配制相应浓度为0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、20.0 μg/mL的对照品溶液，均取0.5 mL，用氮气挥干，用内标环丙沙星溶液(12 μg/mL)0.5 mL溶解残渣，进样分析，得到药物与内标峰面积比。比较前后两个比值计算萃取回收率。结果见表1。

表1 不同浓度萃取回收率实验结果(±SD)(n=5)%Table 1 Experiment Results of the Recovery Rate of Extraction by Different Concentrations(± SD)(n=5) %

表1 不同浓度萃取回收率实验结果(±SD)(n=5)%Table 1 Experiment Results of the Recovery Rate of Extraction by Different Concentrations(± SD)(n=5) %

0.2 89.42±2.57 2.9 86.35±3.58 4.2 1.0 88.16±2.41 2.7 90.02±2.81 3.1 20.0 91.72±2.12 2.3 87.85±2.66 3.0

2.4.2 方法回收率 分别于0.5 mL空白血浆中加入浓度分别为5 μg/mL、25.0 μg/mL、500 μg/mL的氧氟沙星溶液0.2 mL，再分别加入内标环丙沙星溶液0.3 mL，最后分别加水4.0 mL，摇匀，使氧氟沙星浓度分别为0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、20.0 μg/mL，按照 1.3步骤对样品进行处理和色谱分析，分别测得左、右旋氧氟沙星的峰面积，并从左、右旋氧氟沙星的标准曲线上求得其含量，计算回收率。结果见表2。

表2 不同浓度方法回收率实验结果(±SD)(n=5)%Table 2 Experiment Results of the Reccvery Rate by Different Concentrations(± SD)(n=5) %

表2 不同浓度方法回收率实验结果(±SD)(n=5)%Table 2 Experiment Results of the Reccvery Rate by Different Concentrations(± SD)(n=5) %

0.2 99.40±3.44 3.5 86.35±3.58 3.4 1.0 90.12±2.41 3.0 90.02±2.81 3.0 20.0 102.04±5.78 5.7 104.44±5.60 5.4

2.5 精密度实验

2.5.1 日内精密度 按照2.4.1的方法配制5 mL三种不同浓度(0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、20.0 μg/mL)的氧氟沙星血浆，在同日内每种分别取样5次，按1.3“血样预处理”项下操作，测其日内精密度，实验结果见表3。

表3 不同浓度日内精密度实验结果(±SD)(n=5)Table 3 Experiment Results of the Daily Preciseness Degree by Different Concentrations(± SD)(n=5)

表3 不同浓度日内精密度实验结果(±SD)(n=5)Table 3 Experiment Results of the Daily Preciseness Degree by Different Concentrations(± SD)(n=5)

0.2 0.199±0.008 4.1 0.203±0.009 4.2 1.0 0.881±0.021 2.4 0.921±0.022 2.4 20.0 20.085±0.453 2.3 20.475±0.468 2.3

2.5.2 日间精密度 按上法配制血浆样品，每日分别取高、中、低浓度，按1.3方法操作，测定1次，连续

5 d，测其日间精密度。结果见表4。

表4 不同浓度日间精密度实验结果(±SD)(n=5)Table 4 Experiment Results of the Between-day Preciseness Degree by Different Concentrations(± SD)(n=5)

表4 不同浓度日间精密度实验结果(±SD)(n=5)Table 4 Experiment Results of the Between-day Preciseness Degree by Different Concentrations(± SD)(n=5)

浓度/(μg· mL－1)左氧氟沙星精密度RSD/%右氧氟沙星精密度RSD/%0.2 0.194±0.007 3.5 0.204±0.007 3.3 1.0 0.872±0.013 1.5 0.910±0.018 2.0 20.0 19.521±0.213 1.1 20.146±0.276 1.4

2.6 生物样本血药浓度测定

健康志愿者3名，分别口服100 mg氧氟沙星，24 h内在13个时间点静脉取血，离心后，收集上层血浆0.5 mL，再按1.3方法操作，分别测定其不同时间点的各药物的血药浓度。药时曲线见图2。

图2 药时曲线Fig 2 Concentrations of OFLX Enantiomers-Time Curves

3 讨论

HPLC手性流动相添加剂法拆分手性药物，是将手性金属配合剂加入流动相中，与手性化合物形成三元非对映体配合物，由于其结构稳定性和能量的差异，并与固定相发生立体选择性吸引或排斥反应，使对映体分离。此法分析成本低于手性固定相法，利于方法选择。本实验利用氧氟沙星对映体中羧基及邻位羰基与手性配合剂L－异亮氨酸和Cu2+间形成三元非对映体配位化合物使血浆中左、右氧氟沙星得以分离，结果令人满意。

固相萃取是根据液相色谱法分离原理，使液体样品通过吸附剂保留其中某一组分，再选用适当溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目的，适用于对干扰成分多、浓度低、样品量少等的人体生物样品的预处理，常与HPLC技术联合应用于生物样品的分析［7］。本实验采用了人工固相萃取操作，同时考察了固相萃取洗脱剂的体积、浓度、萃取时离心转速及离心时间对药物萃取量的影响。并考察了固相萃取小柱的重复使用情况，发现C18固相萃取小柱在重复使用了5次之后，精密度仍然很满意。

本实验应用HPLC手性流动相添加剂法将血浆中氧氟沙星对映体进行拆分，分离度好，比手性固定相便宜;将固相萃取与HPLC技术结合应用于血浆中氧氟沙星的提取富集及测定，干扰杂质少，萃取效率高;本法采用荧光检测器，灵敏度高。

［1］洪建文，胡昌勤，盛龙生.喹诺酮类药物色谱手性分析的进展［J］.药物分析杂志，2003，23(2):155-159.

［2］叶巧旦.用手性拆分法测定氧氟沙星中左氟沙星含量［J］.现代实用医学，2004，16(2):94.

［3］张哲峰，杨更亮，梁贵键，等.RP-HPLC手性流动相添加剂法拆分甲磺酸帕珠沙星对映体的研究［J］.中国抗生素，2004，29(1):19-22.

［4］唐课文，周春山，蒋新宇.手性溶液萃取分离氧氟沙星对映体［J］.药学学报，2002，37(12):967-970.

［5］张丹丹，郭兴杰，袁 波，等.高效液相色谱手性流动相添加剂分离西孟坦对映体［J］.分析化学，2004，32(2):229-231.

［6］刘学斌，安穗伟.高效液相色谱手性流动相添加剂法拆分尤利沙星对映体［J］.药物分析杂志，2010，30(3):435-437.

［7］黄作君，李中东，施孝金，等.固相萃取技术及其在体内药物分析中的应用［J］.药学服务与研究，2004，4(3):250-252.