UrotensinⅡ对大鼠心脏效应的作用机制探讨

韩清华 刘文媛 李晨娟 王睿 史宏涛

UrotensinⅡ(尾加压素Ⅱ，UⅡ)是最初从硬骨鱼尾部的下垂体中被提取出的一种生长抑素样多肽［1］，主要分布于心血管及神经系统［2，3］，它的缩血管效应是内皮素的 8～10倍［4］。Ames等［5］的研究发现，人体内的孤儿受体 G 蛋白偶联受体14(G-protein coupled receptor 14，GPR14，UT)是 UⅡ的特异性受体。UⅡ与UT结合后，可产生多种生物学效应，如促进内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌纤维细胞的增殖、强烈的收缩血管作用及心脏抑制等心血管效应。其作用途径很多，可能有钙(Ca2+)、磷脂酶、酪氨酸激酶、RhoA等因子参与［6］，但具体通过哪条信号转导通路发挥效应尚不清楚。本研究利用全细胞膜片钳技术，观察UⅡ对大鼠心肌细胞L-型钙电流的影响，并选用特异性 PKA拮抗剂-KT5720，研究KT5720对UⅡ作用的阻断效应，进而阐明UⅡ作用于大鼠心脏效应的可能电生理机制及信号转导通路。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠，♂，体重200～250 g，由山西医科大学实验动物中心提供。主要试剂:UrotensinⅡ(human)与KT5720购自英国TOCRIS公司;牛磺酸(taurine)、L-谷氨酸(L-glutamic acid)、乙二醇四乙酸(EGTA)、HEPES(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid)均购自美国Sigma公司;胶原酶P(Collagenase P)购自德国Bochringer Mannhein公司;其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 单个心室肌细胞的急性分离 取大鼠击头致昏，迅速剪断颈部放血，开胸取出心肺，立即置于0℃氧饱和的无钙台式液中修剪，然后将心脏挂在Langendorff灌流装置上经主动脉逆行灌流，流速2 ml/min。先用无钙台式液灌流7～8 min，再用酶液循环灌流15～20 min。灌流过程中保持37℃恒温，灌流压为70 cmH2O，并持续通以100%氧气。待心脏组织变大、变软后将左心室肌组织剪下来，置于KB液中轻柔吹打，得到分散的心室肌细胞，经150 μm孔径的滤网过滤后保存于KB液中，室温下稳定1 h后，放入4℃冰箱静置2 h备用。

1.3 全细胞膜片钳记录 实验前先将存放于KB液中的心室肌细胞复钙，复钙终浓度为1.8 mmol/L。吸取适量细胞悬液滴加于灌流槽中，放置5～10 min使细胞牢固贴壁后，用细胞外灌流液以1～2 ml/min匀速灌流，使细胞逐渐复钙，10～20 min后，于倒置相差显微镜下选择贴壁牢固、无跳动、横纹清晰、折光性好、立体感强的细胞进行实验。玻璃微电极由PP-83型二步拉制仪(Narishige Co，Japan)拉制而成，充灌电极内液后，电极电阻为2～5 mΩ。用微电极操纵器(Narishige Co，Japan)将电极推向细胞，负压吸引形成高阻封接，电击破细胞膜，补偿电容电流和串联电阻，形成全细胞记录模式记录ICa-L。细胞破膜后5 min开始记录Ica-L，电流值以电流密度(pA/pF)表示。以上记录均在室温下进行。信号经Axopatch-200B膜片钳放大器放大、Digidate 1322A模数转换器转换，通过pClamp8.2软件进行数据采集、储存及分析。

L-型钙电流记录:在全细胞模式下，用TEA-Cl、CsCl阻断电压依赖性的Ik，从钳制电位-40 mV开始，以10 mV步阶逐步去极化至+50 mV，电压刺激时程为300 ms，刺激频率为0.1 Hz激活Ica-L。心肌细胞分离及全细胞电流记录方法参照文献。

1.4 溶液组成 台氏液(mmol/L):KCl 5.4;NaH2PO40.33;HEPES 5.0;Glucose 10.0;MgCl21.0;NaCl 140;CaCl21.8;用NaOH调pH值到7.35～7.40。无钙台氏液:去除钙离子的台式液。酶液(mmol/L):KCl5.4;NaH2PO40.33;HEPES 5.0;Glucose 10.0;MgCl21.0;NaCl 125;Taurine 20.0;CaCl275 μmol/L;胶原酶P 5～7 mg。KB液(mmol/L):L-谷氨酸50.0;KCl 30.0;牛磺酸20.0;KH2PO430.0;HEPES 10.0;Glucose 10.0;MgCl21.0;EGTA 0.5;用KOH调pH值到7.35～7.40。

L-型钙电流(Ica-L)的电极内液(mmol/L):KCl 150;HEPES 5.0;EGTA 5.0;K2ATP 3.0;MgCl21.0;4-AP 5.0;MgATP 1.0，;用KOH调pH值到7.3。细胞外灌流液为台式液。

1.5 统计学处理 原始数据经Clampfit处理。实验数据以均数±标准差()表示。两样本均数间比较用t检验，多个样本均数间比较用方差分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UⅡ对大鼠心肌细胞Ica-L的影响

2.1.1 不同浓度的UⅡ对大鼠心肌细胞Ica-L的影响 10-9～10-5mol/L UⅡ灌流5 min后，UⅡ呈浓度依赖性的抑制大鼠心肌细胞Ica-L，10-6和10-5mol/L UⅡ的下降率明显大于对照组(P＜0.01，n=10)(图1)。

图1 10-9～10-5mol/L UⅡ灌流后，UⅡ呈浓度依赖性的抑制大鼠心肌细胞Ica-L

2.1.2 不同浓度UⅡ对大鼠心肌细胞L-型钙电流密度的影响(表1，图2)

表1 不同浓度UⅡ对大鼠心肌细胞L-型钙电流密度的影响

2.2 KT5720对UⅡ作用于大鼠心肌细胞Ica-L的影响(图2)。

图2 灌流KT-5720基础上给予UⅡIca-L变化不明显

3 讨论

UⅡ是迄今为止发现的收缩血管活性最强的物质，可引起心功能抑制、心肌收缩力减弱等心血管效应。因此，UII对心血管系统的效应仍是当今研究的热点。本课题组在前期研究中，利用Langendorff离体大鼠心脏模型，用不同浓度的UⅡ(10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)依次灌注正常大鼠心脏，±dp/dtmax抑制率随浓度增加而增大，呈剂量依赖性抑制作用。

为进一步探讨UⅡ作用于心脏的电生理机制，本研究采用全细胞膜片钳技术，观察到UⅡ呈浓度依赖性的抑制大鼠左心室心肌细胞Ica-L。正常状态下心室肌细胞L-型钙通道开放，细胞外Ca2+内流，通过细胞内Ca2+诱导的钙释放机制引起钙池释放钙，从而使胞浆内Ca2+水平升高，引起心肌收缩。在本实验中我们观察到UⅡ能减弱心肌细胞L-型钙电流强度，抑制细胞外钙离子内流，进而降低细胞内Ca2+浓度，从而抑制心肌收缩。因此我们推测UⅡ对心功能的抑制作用是与抑制钙电流有关。

目前研究显示UⅡ与其受体结合后的作用途径很多，可能有钙(Ca2+)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、磷酸肌醇、酪氨酸激酶、小型的 GTP酶RhoA及效应器Rho激酶-RhoK等因子参与，但具体通过哪条途径发挥效应尚有争议，因此UⅡ对心血管系统的作用转导机制尚不清楚。本研究选用特异性PKA拮抗剂-KT5720，在单个心肌细胞L-型钙电流的记录中，观察到在灌流KT-5720基础上给予UⅡ，L-型钙电流密度峰值变化不明显，表明KT-5720可阻断UⅡ对钙电流的抑制作用。由此我们推测，UrotensinⅡ可能通过PKA途径抑制心肌细胞L-型钙电流而发挥其心功能抑制作用。

UⅡ作为收缩血管活性最强的物质，目前已成为心血管疾病治疗的潜在的靶点。但是UⅡ作用非常广泛而且复杂，其生物学作用还有待于进一步的研究。

［1］David P.Johne S，Brianr C.et al.Urotensin Ⅱ:A somatostatinlike peptide in the caudal neurosecretory system of fishes.Proc Natl Acad Sci，1980，77(8):5021.

［2］Zhu Y C，Zhu Y Z，Moore P K.The role of urotensin II in cardiovascular and renal physiology and diseases.Br J Pharmacol，2006，148(7):884-901.

［3］Zhu X M，Du G H.Progress in the study of biological activities of urotensinⅡ.Chin Pharmacol Bull，2006，22(6):651-4.

［4］Tasaki K，Hori M，Ozaki H，Karaki H，Wakabayashi I.Mechanism of human urotensin II-induced contraction in rat aorta.J Pharmacol Sci，2004，94(4):376-83.

［5］Ames RS，Sarau HM，Chambers JK，et al.Human urotensinⅡis a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14.Nature，1999，402(6764):898-903.

［6］Maguire J J，Davenport A P.Is urotensin-Ⅱ the new endothelin?.Br J Pharmacol，2002，137(5):579-588.

［7］Yazawa K，Kaibara M，Ohara M，et al.An improved method for isol-ating cardiac myocytes useful for pathch-clamp studies.Jpn J Physiol，1990，40:157-163.