EMMPRIN和Ki-67在panc-1荷瘤裸鼠束缚应激模型移植瘤中的表达及意义

姜旭平 李玉军

胰腺癌是一种恶性度高、预后极差的恶性肿瘤。近年来发病率逐年增加，虽然临床综合诊治水平不断提高，但对其远期疗效和预后并未带来突破性影响，患者5年生存率不足2%，因为心理恐惧和躯体疼痛，可以推测大部分胰腺癌患者必然处于应激状态。本研究旨在建立裸鼠胰腺癌束缚应激模型，模拟胰腺癌患者所处的应激状态，通过检测移植瘤组织中EMMPRIN和Ki-67蛋白的表达情况，探讨应激促进裸鼠胰腺癌移植瘤生长的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人胰腺癌细胞株panc-1(中国协和医院微生物实验室);BALB/C(nu/nu)裸小鼠，雄性，4～6周龄，体质量15～18 g(上海斯莱克实验动物有限责任公司);EMMPRIN抗体和Ki-67抗体(北京中杉金桥生物公司)等。

1.2 方法

1.2.1 建立裸鼠胰腺癌移植瘤束缚应激模型 新购的裸鼠饲养在室温26℃～28℃相对无菌的环境中，饲料和水均经过高压灭菌，将20只裸鼠随机分为两组:荷瘤+应激组和单纯荷瘤组，每组10只。荷瘤+应激组的裸鼠在种瘤后给予束缚(每天10:00～18:00，共2周)，单纯荷瘤组裸鼠正常活动。结束后处死全部裸鼠，取移植瘤，具体步骤参考文献［1-3］。

1.2.2 免疫组化 采用PV-6000法，按试剂盒说明书进行操作。结果判定:EMMPRIN染色阳性细胞为胞膜呈棕黄色，Ki-67染色阳性细胞为胞核呈棕黄色，具体判定标准按许良中等［4］所述。

1.3 统计学方法 用SPSS16.0软件进行分析。数值资料以均数±标准差()表示，采用t检验;等级资料采用非参数统计秩和检验(Mann-Whitney Test);相关性分析采用Spearman等级相关性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤裸鼠体质量和瘤质量 实验前两组裸鼠体质量比较，差异无统计学意义［n=10，(15.76±2.07)g vs(15.67±2.22)g，t=0.091，P ＞0.05］，单纯荷瘤组实验后体质量明显大于荷瘤 +应激组，差异有统计学意义［n=10，(21.78±1.40)g vs(20.26 ±1.10)g，t=2.713，P ＜0.05］，束缚应激使裸鼠体质量增长缓慢。与单纯荷瘤组相比，束缚应激可使移植瘤质量明显增加［(0.96±0.41)g vs(1.45±0.42)g，t=-2.685，P ＜0.05］。

2.2 免疫组化结果 荷瘤+应激组移植瘤组织中EMMPRIN和Ki-67的阳性表达明显高于单纯荷瘤组，差异有统计学意义(Z=-2.636、-2.033，P ＜0.05)。见表1。

表1 两组裸鼠移植瘤组织中EMMPRIN和Ki-67的表达

2.3 EMMPRIN和Ki-67表达的相关性 裸鼠胰腺癌移植瘤组织中EMMPRIN的表达与Ki-67的表达存在正相关性(r=0.534;P＜0.05)。

3 讨论

EMMPRIN属于免疫球蛋白超家族(IgSF)成员，是一种分子质量约50000～60000的高度糖基化的跨膜糖蛋白，在肿瘤细胞的胞膜含量丰富，可作用于邻近的肿瘤细胞以及间质中的成纤维细胞，分泌基质金属蛋白酶(MMPs)，降解基底膜，水解肿瘤细胞表面的黏附成份，使细胞与细胞之间、细胞与基质间黏附力降低，而有助于癌细胞的迁移［5］。本实验结果显示荷瘤+应激组移植瘤组织中EMMPRIN的阳性表达显著高于单纯荷瘤组，提示应激能刺激肿瘤细胞产生分泌EMMPRIN蛋白，导致其活性升高，并导致可溶性的EMMPRIN蛋白的释放，进而又可通过旁分泌途径促进邻近的成纤维细胞产生MMPs和EMMPRIN，形成正反馈的调节机制，促进肿瘤的浸润。

Ki-67是一种细胞核增殖相关抗原，其表达在增殖细胞的G1、S、G2、M期，在G0期细胞中不表达，主要用来判断细胞的增殖活性，可标识肿瘤的增殖速度。本实验荷瘤+应激组移植瘤组织中Ki-67的阳性表达显著高于单纯荷瘤组，说明束缚应激增强了胰腺癌细胞的增殖活性，促进肿瘤的生长和转移。

肿瘤的发生发展是一个及其复杂的过程，需要多种因子的共同参与。本实验结果显示裸鼠胰腺癌移植瘤组织中EMMPRIN与Ki-67的表达呈正相关，提示EMMPRIN高表达可促进肿瘤细胞增殖但EMMPRIN提高肿瘤细胞的增殖能力的确切机制目前仍不是很清楚。

总之，本文的研究结果说明慢性应激促进裸鼠胰腺癌细胞生长可能是通过上调EMMPRIN的表达，诱导肿瘤细胞增殖，我们的实验结果为胰腺癌的治疗提供新的思路。

［1］黄鹏，王春友，吴河水，熊炯圻.胰腺癌细胞株PANC-1中肿瘤干细胞生物学行为的研究.中国普通外科杂志，2008，17(9):865-869.

［2］汤志刚，孙振阳，胡何节，许戈良，陈炯，李建生.TFPI22对胰腺癌细胞体内和体外侵袭能力的影响.中国普外基础与临床杂志，2008，15(1):46-50.

［3］余立群，刘福军，高国兰，孙玉芳，喻小念，聂春莲，楮芳.人卵巢上皮性癌荷瘤裸鼠不良心理应激模型的建立.中国肿瘤临床，2009，36(20):1187-1189.

［4］许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准.中国癌症杂志，1996，6(4):229-231.

［5］战明侨，李玉军.EMMPRIN和MMP一2表达与胰腺癌生物学行为关系.齐鲁医学杂志，2010，25(4):300-302.