丹皮酚诱导人MCF-7细胞凋亡的机制

王建杰 罗文哲 苗 智 宋汉君 齐建祥 王茉琳 (佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 54007)

丹皮酚诱导人MCF-7细胞凋亡的机制

王建杰 罗文哲 苗 智 宋汉君 齐建祥1王茉琳 (佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的 观察丹皮酚诱导人MCF-7乳腺癌细胞凋亡形态学和凋亡率的机制。方法 应用MTT法观察丹皮酚对MCF-7细胞的细胞毒作用;应用hoechst单染观察丹皮酚对肿瘤细胞形态学的影响;Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞仪测定丹皮酚诱导MCF-7细胞凋亡的凋亡率。结果

丹皮酚作用于MCF-7细胞的IC50为60 mg/L;细胞形态学出现核碎裂、凋亡小体等典型的细胞凋亡特征;60 mg/L丹皮酚作用24 h、48 h的凋亡率分别为14.24%和28.47%。结论 丹皮酚通过诱导MCF-7细胞凋亡而抑制肿瘤细胞生长。

丹皮酚;细胞凋亡;乳腺癌

牡丹皮的有效成分具有解热镇痛、抗炎和免疫调节、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中枢抑制作用。临床研究发现，在宫颈癌、肝癌、肺癌、喉癌、乳腺癌等有效治疗方剂中均包含有牡丹皮〔1〕。丹皮酚 (Paeonol)是牡丹皮中的主要活性成分。据文献报道，丹皮酚能抑制某些肿瘤细胞的增殖，如人白血病细胞株(K562)，人肝癌细胞株(Bel-7404)，人宫颈癌细胞株(HeLa)以及人大肠癌细胞株(HT-29)，并能够增强化疗药物顺铂抗食管癌的作用〔2〕。本课题组应用丹皮酚处理小鼠乳腺癌(EMT6)模型，证实丹皮酚具有抗乳腺癌的作用〔3〕。但对于人的乳腺癌细胞尚没有相关报道。本研究应用人乳腺癌细胞株MCF-7细胞观察丹皮酚作用于乳腺癌的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人MCF-7细胞株购于中国医学科学院肿瘤研究所细胞库。RPMI 1640培养液购于Gibco公司，胎牛血清来源于Hyclone公司。四甲基偶氮唑蓝 (MTT)为北京拜尔迪生物技术公司产品。二甲基亚砜(DMSO)为Sigma Aldrich Inc公司产品。Hoechst购于beyotime公司。Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒购自南京KeyGen生物技术有限公司。流式细胞仪，Epics-XLⅡ型，美国Becton Dickinson公司;荧光显微镜及照相系统，日本Nikon公司;Multiskan MK3型酶标仪，美国Thermo公司。

1.2 细胞培养

将人MCF-7细胞以适量浓度接种于9 cm细胞培养皿中。加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃，5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长，每2～3 d传代1次。试验均于细胞处于对数生长期时进行。

1.3 MTT法检测丹皮酚对MCF-7细胞增殖活性的影响

将处于对数生长期的细胞用胰酶进行消化，调整细胞密度至5 ×104～1 ×105/ml，接种于 96 孔培养板中，每孔 100 μl，培养24 h，加入不同浓度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 mg/L)的丹皮酚，每个浓度均设4个平行孔，用RPMI1640完全培养液作为阴性对照组，同时设空白调零，放于37℃、5%CO2培养箱中继续培养 24 h、48 h 后，每孔加入 5 mg/ml的 MTT 20 μl，于培养箱中继续培养4 h后，加入200 μl DMSO溶液，振荡10 min后酶标仪于492 nm处测OD值，按式计算细胞生长抑制率。

细胞增殖抑制率(%)=(1－实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 Hoechst 33342荧光单染观察细胞形态学

调细胞密度至5×104个/ml，接种于 6孔板中，每孔 3 ml，24 h后，吸弃培养液。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，60 mg/L丹皮酚处理细胞，阴性对照组为RPMI1640完全培养液，继续培养24 h、48 h后，每孔加入100 μl Hoechst 33342(终浓度 10 μg/ml)，4 ℃ 避光染色15～20 min，荧光显微镜下观察，拍照。

1.5 Annexin V-FITC染色检测MCF-7细胞凋亡

5×104个/ml细胞悬液接种于6孔板，每孔3 ml，24 h后以60 mg/L丹皮酚处理细胞，RPMI1640为对照，24 h、48 h后，胰酶消化，收集细胞，按试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测细胞凋亡率，激发波长488 nm。以CellQuest软件分析结果。

2 结果

2.1 细胞形态学变化

60 mg/L的丹皮酚处理MCF-7细胞24 h、48 h后，Hoechst荧光染色结果显示，细胞出现明显的凋亡形态学改变，细胞变小，细胞核呈碎裂状态，蓝色激发光强于阴性对照组细胞，荧光变得致密，因此核被染成亮蓝色，并可见明显的粒状荧光体聚集，新月体样改变，凋亡小体形成等，以48 h后变化更明显。见图1。

图1 丹皮酚对MCF-7细胞形态的影响(×400)

2.2 丹皮酚对细胞增殖活性的影响

丹皮酚处理MCF-7细胞24 h的IC50高于250 mg/L，而丹皮酚处理MCF-7细胞48 h后的IC50约是60 mg/L，说明丹皮酚作用48 h后对MCF-7细胞增殖具有直接抑制作用，并呈剂量依赖性关系。

2.3 Annexin V-FITC染色检测MCF-7细胞凋亡

以60 mg/L丹皮酚处理MCF-7细胞24、48 h后，丹皮酚能诱导MCF-7细胞出现了明显的凋亡，60 mg/L丹皮酚24 h、48 h的凋亡百分数分别为14.24%和28.47%，比对照组的凋亡百分数(5.54%)明显增加。

3 讨论

MTT分析是以代谢还原MTT为基础的方法。在细胞增殖过程中活细胞线粒体脱氢酶可将黄色可溶性MTT分子内环状结构断裂形成蓝紫色不溶性甲臜，DMSO可以使之溶解，酶标仪则可在一定波长下检测光密度值;死亡细胞中线粒体脱氢酶消失，无法使MTT还原，因此不能形成蓝紫色甲臜，观察不到颜色变化。MTT法较其他方法如台盼蓝计数法相比具有客观性强、简单易行等优点，因此被广泛用于抗肿瘤药物的初筛。

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡 (PCD)，是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。通常认为恶性转化的肿瘤细胞是因为失控生长、过度增殖。从细胞凋亡的角度来看则认为是肿瘤的凋亡机制受到抑制不能正常进行细胞死亡清除的结果。许多化疗药物能够诱导肿瘤细胞凋亡，如紫杉醇、顺铂、长春新碱等，诱导肿瘤细胞凋亡也成为肿瘤治疗的一个重要的策略。目前很多药物的开发和研制都把诱导细胞凋亡作为药物疗效的一个衡量指标〔4，5〕。

本试验证明丹皮酚诱导了人MCF-7发生了细胞凋亡。丹皮酚通过诱导MCF-7细胞凋亡而发挥抗乳腺癌作用。

1 Tang B，Jiang J.Study of the CpG methylation status of ER alpha gene in estrogen receptor alpha-negative breast cancer cell lines and the role of hydralazine demethylation〔J〕.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2005;34(5)：283-7.

2 Mimura K，Baba S.Determination of paeonol metabolites in man by the use of stable isotopes〔J〕.Chem Pharm Bull，1981;18(7)：2043-50.

3 Wang J，Qingwang L，Yetao O，et al.Antitumor effects of paeonol on mice bearing EMT6 breast infiltrating ductal carcinoma〔J〕.Lat Am J Pharm，2010;29(5)：369-75.

4 Reed JC.Mechanisms of apoptosis〔J〕.Am J Pathol，2000;157(5)：1415-30.

5 Mlejnek P.Caspase inhibition and N6-benzyladenosine-induced apoptosis in HL-60 Cells〔J〕.J Cell Biochem，2001;83(4)：678-89.

R737.9

A

〕 1005-9202(2012)22-4953-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.046

黑龙江省自然科学基金资助(No.D201063);黑龙江省教育厅科研项目(No.12521555)

1 佳木斯大学附属第二医院

齐建祥(1963-)，男，主任医师，主要从事心血管内科临床治疗研究。

王建杰(1968-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事中药抗肿瘤分子机制的研究。

〔2012-03-20收稿 2012-04-10修回〕

(编辑 袁左鸣)